Cours 5 Flashcards
Sequencage sanger
Utilisation de ddNTP
(4 puits - ADN matrice, dNTP, amorce, ADN polymerase & 1 ddNTP marque par puit)
3 méthodes d’analyse de plasmide
Sequencage (ex. Sanger)
Analyse par digestion (carte de restriction)
Analyse par hybridation spécifique (sonde marquée pour identifier présence d’une séquence d’ADN spécifique)
Sequencage sanger
Ou sont les résultats clairs? (Signal de fluorescence)
Au milieu de la séquence (20-700 nucleotides)
—> début de séquence et +700 nuc = résultats pas clairs
utilisation de plusieurs amorces pour séquences longues
Que veut dire un nucleotide N dans sequencage sanger?
Résultats pas concluants par l’ordinateur
—> soit vérifier chromatogramme ou refaire sequencage
Sequencage de nouvelle génération
(Next Gen sequencing)
—> permettent quoi?
Illumina
Analyse simultanée de bcp d’ADN en même temps
—> permet analyse génomique
(Évolution, pathologie, etc)
Sequencage illumina
In vitro
1) fragmentation d’ADN & ajout d’oligonucleotides
2) formation d’agrégats d’ADN sur puce microfluidique
—> amplification par pontage / bridge
3) sequencage cyclique
—> terminateurs fluorescents a chimie réversible sur chaque dNTP différent
Lavage avec dNTP, capture de fluorescence, lavage pour enlever blocage d’extension, répéter
3es génération sequencing caractéristique?
Permet sequencage de longs fragments
—> longue lecture d’info genetique
—> pas besoin d’assembler les courtes lectures - erreurs possibles
Ex. Nanopores, Pacific Biosciences (PacBio)
mais taux d’erreur élevé (10-15%)
Alors = lectures multiples
Pourquoi est-ce que le NGS (Next-Gen Sequencing) est limite à des lectures courtes?
(~300 nuc ou moins)
Perte de synchronisation parmi les polymerases = perte de signal fort
Lors de l’amplification clonale
Combien d’ajouts de nucleotides sont possibles par cycle dans illumina?
1 seul - gr bloquant inhibe l’ajout de plusieurs nucleotides
(Lavage avant de continuer au prochain cycle)
Quels sont les brins qui vont être séquences en illumina?
Seulement les brins identiques à la molécule de départ
—> brins complémentaires enlevés
3 étapes de digestion diagnostique
(Carte de restriction)
1) digérer l’ADN avec 1+ enzymes de restriction
2) déterminer la taille des fragments générés par éléctrophorèse
3) Utiliser cette information pour prédire la position des sites de restriction sur l’ADN
Bandes prévues après digestion dans ADN linéaire et plasmide
• ADN linéaire : 1 bande de plus que de sites de restriction (coupures)
• plasmide: # égal de bandes que de sites de restriction (coupures)
Carte de restriction / fingerprinting permet quoi?
1) trouver la taille de l’ADN
Ou
Trouver la taille de l’ADN et présence de l’insert
2) déterminer l’orientation de l’insert
Méthodes de détection par hybridation
Southern blot—> ADN
Northern blot —> ARN
Hybridation de colonies —> ADN de b
Dot- blot —> ADN
Particularité de la sonde pour détecter une séquence d’intérêt dans un mélange
La sonde doit être “marquée” afin d’être différenciable du pool d’acides nucléiques
Stringence, déterminée par:
Déterminée par la concentration en sel et la température
—> haute stringence : T haute et sel faible
(Hybridation difficile - seulement complémentarité haute)
—> basse stringence : T basse et conc. de sels haute
(Hybridation favorisée)
Méthodes de marquage des sondes
1) Marquage par incorporation de nucléotide radioactif
2) Marquage par incorporation de nucléotide marqué avec un haptène (Biotine, digoxygénine)
3) Marquage par incorporation de nucléotide fluorescent (fluorochrome: fluorescein, Rhodamine etc…).
Pourquoi l’utilisation de spacers avec les molecules fluorescentes?
pour créer une distance entre le nuc et la molécule fluorescente qui est grosse
(pourrait interférer avec l’utilisation du nuc et ainsi de l’hybridation)
2 types de marquage par sondes
1) Marquage des extrémités:
• marquage de lʼextrémité 3ʻ
• marquage en 5ʼ
2) Marquage uniforme interne:
• marquage aléatoire
• marquage de l’ARN par transcription in vitro
Marquage par extension de bouts collants
Marquage par extension de bouts collants générés par digestion par une enzyme de restriction
1) digestion par enzyme (EcoRI)
—> crée extensions 5’
2) polymerase fait séquence complémentaire avec dATP marqués
(Phosphate alpha)
Marquage à l’extrémité 3’ par une terminal transférase
Marquage de l’extrémité 5’
1) traitement avec phosphatase
2) phosphorylation avec phosphate gamma marqué
Marquage par amorce aléatoire
marquage interne
1) dénaturation des brins
2) hybridation de hexanucleotides aléatoires
3) ADN polymerase avec un dNTP marque
Marquage dʼARN par transcription in vitro
Stratégie d’utilisation d’une sonde
1) dénaturer ADN et sondes marqués
2) mélanger et hybrider
3) visualiser sonde hybridée au l’ADN
Southern-Blot & Northern-Blot
méthode qui permet de détecter spécifiquement une séquence d’ADN (Southern) ou d’ARN (Northern) dans un mélange complexe séparé par électrophorèse
—> Dans les deux techniques les acides nucléiques sont transférés et immobilisés sur une membrane (nitrocellulose) après l’électrophorèse. L’hybridation de la sonde est réalisée sur la membrane.
Hybridation de colonies de bactéries
1) placer membrane de nitrocellulose sur gel d’agaric avec colonies
2) inverser la membrane sur une nouvelle Agar, laisser les colonies se régénérer
3) laver la membrane avec les colonies par solutions
• dénaturation
• neutralisation
• lavage
• fixation d’ADN
—> ADN bactérien fixe sur la membrane
4) hybrider avec sonde marquée et faire autoradiographie pour détecter quelles colonies sont d’intérêt
5) prendre colonie correspondante des c originales & placer dans culture liquide
Dot-Blot
Fixation si hybridation?
—> pas d’info sur la taille des fragments détectés
Micropuce à ADN (DNA microarray)
Fonctions :
• Etude de l’expression des gènes dans des échantillons complexes
• Etude des polymorphismes (SNPs)
• Comparer différents tissus du même organisme (cerveau vs foie)
• Comparer différents conditions (tumeur vs tissu sain)
• Comparer des tissus WT et mutant
• Analyser l’expression au cours du développement (comparaison à des temps différents)
• Analyses la réponse à un stimulus
Micropuce à ADN (DNA microarray)
Étapes:
1) Support = lame de microscope traitée pour assurer la liaison des acides nucléiques
2) ADN individuels ou oligonucléotides déposés de manière robotisée à des positions uniques (coordonnés x, y)
3) lame scannee et fluorescence mesurée
Importance de la Bioinformatique en Biologie Moléculaire
La bioinformatique a la capacité de valoriser une vaste quantité de données à des fins thérapeutiques.
Sondes de PCR quantitative (2)
1) SYBR Green —> fluorescent uniquement lorsqu’il est lié à un double brin d’ADN
2) TaqMan Probes —> fluorescence uniquement lorsque le quencher est libéré
Différence PCR normal et PCR quantitatif
—> PCR quantitatif est en «temps réel»
—> il analyse l’incorporation de sondes fluorescentes
PCR quantitative —> fluorescence proportionnelle à quoi?
La fluorescence détectée à chaque cycle est proportionnelle à la quantité d’ADN qu’on avait au départ
RT-qPCR versus qPCR
(reverse transcriptase qPCR)
RT-qPCR se fait en 1 étape
qPCR se fait en 2 étapes
(RT, et ensuite qPCR)
—> avantageux si on veux utiliser l’ADNc ultérieurement
