Cours 2 Flashcards
3 activités de l’ADN Pol I de E. Coli
1) polymerase 5’—>3’
2) exonuclease 3’—>5’
3) exonuclease 5’—>3’
4 facteurs affectant l’hybridation des acides nucléiques
1) composition en bases de la région d’hybridation
(GC : 3 ponts H, AT: 2 ponts H)
2) degré de complémentarité des séquences à hybrider ( bases mal-appariées ?)
3) température
4) composition en sel de la rx d’hybridation
—> squelette chargé - : ions + (sel) peuvent neutraliser les charges - et favoriser l’hybridation
% idéal de paires d’acides nucléiques pour avoir une hybridation efficace
GC = 50-60%
Si trop faible : hybridation non-efficace
Si trop haut : appariement trop fort = difficulté de desappariement
Zone haute en AT va:
Hybrider difficilement
Tm (température de fusion) calcul
2(A+T) + 4(G+C)
Température d’hybridation optimale
Tm - 5 dégrées C
2(A+T) + 4(G+C) -5
Températures des 3 étapes de PCR
1) 95 C
dénaturation
2) Tm - 5 C
Hybridation
3) 72 C
Polymérisation
Le temps de polymérisation dépend de quoi?
De la taille et structure du gène à amplifier
Après combien de cycles a-t-on le fragment désiré seul?
Après 3 cycles
Les amorces sont incluses au PCR à faible ou haute concentration?
Pourquoi?
A haute concentration pour surpasser l’hybridation des 2 brins complémentaires à nouveau
Différence d’oligonucléotide amorce dite «en amont» et «en aval»
Fidélité de la Taq polymerase
1 erreur / 3500 nuc ajoutés
Fonction du domaine de liaison
Augmenter le temps de rétention de la polymerase sur l’ADN
(Important pour longs segments)
Définition de processivite d’une polymerase
Nucleotides incorpores par liaison à l’ADN
Comment ajouter de nouvelles séquences d’ADN par PCR?
En utilisant des amorces avec des nouvelles séquences du côté 5’ de l’amorce
Comment obtenir un gène sans introns avec PCR
1) isoler ARNm (deja épissé)
2) ajouter première amorce avec transcriptase inverse et dNTP
3) dénaturer hybride ARN-ADN
4) ajouter 2e amorce & poursuivre avec PCR
3 types d’amorces différentes
(Pour ARNm)
1) amorce oligo dT
S’hybride a la queue poly-A
2) amorce spécifique
S’hybride à une séquence spécifique connue
3) amorce «random»
S’hybride à 6 nt —> grande variété d’ARNm sans poly-A
(Ex. ARNr)
L’ADN est séparé sur quel type de gel?
1) Gel d’agarose avec tampon EDTA
ADN séparé en fct de leur taille & forme
2) gel de polyacrylamide
(Pour fragm. + petits)
L’ADN migre vers la cathode ou l’anode?
ADN (-) migre vers l´anode (+)
Cathode (-)
Fonction des colorants dans un gel d’agarose
Colorants (molécule fluorescente) s’intercale dans les acides nucléiques pour visualiser les ac. Nucléiques (la progression) dans le gel
(agents intercalants dans l’ADN = mutagènes )
La distance parcourue sur un gel d’agarose est inversement proportionnelle au:
Log 10 de la masse moléculaire de l’ADN
—> C d’agarose influence aussi
C élevée pour fragm. d’ADN plus petits
—> forme de l’ADN influence aussi
Loi de Beer-Lambert
Utilité ?
A=E l C
Absorbance = coefficient d’extinction molaire x longueur du trajet optique (cm) x concentration
Utilisée pour calculer la concentration en fonction à son absorbance
Concentration de l’ADN mesure par absorbance à quelle longueur d’onde?
260 nm
Concentration de protéines mesuré par absorbance à quelle longueur d’onde?
280 nm
Pureté d’ADN estimée par le ratio 260nm/280nm devrait être égale à quoi?
1.7-1.9
