Cours 1

Question 1

2 types de clonage

Answer 1

1) clonage cellulaire (a l’échelle cellulaire)
2) clonage reproductif (a l’échelle de l’organisme entier)

Question 2

Clonage =

Answer 2

Technologie de l’ADN recombinant
(Isoler et amplifier à l’identique une séquence d’ADN d’intérêt)

Question 3

ADN recombinant provient de:

Answer 3

Combinaison entre l’ADN d’un organisme donneur et celui d’un vecteur (peut être d’une espèce différente)

Question 4

Applications de la technologie d’ADN recombinant

Answer 4

1) analyser l’ADN génomique , sequencage de l’ADN
2) analyser la structure et l’expression de l’ARNm
3) expression de protéines recombinantes (bactéries, système mammifère, modèle animal)
4) produire Ag pour générer de Ac
5) générer vaccins et med. recombinants

Question 5

Étapes pour avoir un ADN recombinant ou produits du gène

Answer 5

1) isolement du gène d’intérêt (avec enzymes de restriction)
2) insertion du gène dans un vecteur avec un marqueur (pour repérer les cellules modifiées) et un promoteur (permet le gène de s’exprimer)
3) vecteur modifié est introduit dans un organisme (E. Coli ou autre)
4) bactérie mise en culture = réplication accélérée
5) extraction du plasmide modifié ou du gène d’intérêt cloné
5) utilisation du produit (protéine)

Question 6

4 outils de clonage

Answer 6

1) vecteurs de clonage
2) cellules hôtes
3) enzymes pour manipuler l’ADN
4) techniques reliées au clonage et à l’analyse

Question 7

Définition d’un vecteur

Answer 7

Séquence d’ADN permettant la propagation, la sélection, et la modification d’une séquence d’ADN d’intérêt

L’ADN dans lequel on insère le fragment d’ADN à étudier (adn exogène)

Généralement des plasmides ou bacteriophages

Question 8

4 vecteurs

Answer 8

Choix en fonction de la taille du gène à cloner

1) plasmides (<10kb)
2) bacteriophages (25-100 kb)
3) cosmides (vecteur artificiel d’un plasmide hybride contenant la séquence cos du phage lambda) (45 kb)
4) autres: BAC-bacterial, YAC-yeast, HAC-human
(X artificial chromosome)

Question 9

Contenu du vecteur

Answer 9

1) marqueur de sélection
2) origine de réplication
3) site de clonage (polylinker)

Les éléments non essentiels sont remplacés par l’ADN d’intérêt/etranger

Question 10

Définition cellule hôte

Answer 10

Cellule hébergeant un matériel génétique étranger apporté par un virus, plasmide, ADN recombiné in vitro, ou une cellule entière

Question 11

Exemple de cellules hôte

Answer 11

1) bactéries - taux d’expression élevé , sécrètent mal les protéines (éclatement des bactéries) , pas de modif. post-traductionelles
2) levures - modif. Post- traductionelles, difficile sécrétion de protéine
3) cellules de mammifères - cher, rendement faible, protéines complexes faisables
4) cellules d’insectes

Question 12

Enzymes pour copier adn/arn

Answer 12

ADN/ARN polymerase (5’->3’)

Question 13

Enzymes pour Couper ADN/ARN

Answer 13

Exonuclease (5’->3’) (3’-5’)
Endonuclease
Topoisomerase
Recombinase

Question 14

Enzymes pour coller ADN/ARN

Answer 14

ADN/ARN ligase
Topoisomerase
Recombinase

Question 15

Enzymes pour modifier adn

Answer 15

Phosphatase (dephosphoryle)
Phosphokinase (phosphoryle)
Terminal transferase

Question 16

Fonction adn polymerase

Answer 16

Synthèse du brin complémentaire avec un ADNsb et des dNTP
Attaque nucleophile sur 3’OH

Synthèse 5’ -> 3’