Cours 6 - Chromatographie liquide 1 Flashcards
Qu’est-ce que la HPLC et à quoi sert-elle ?
La HPLC, ou chromatographie liquide à haute performance, est une méthode analytique puissante qui permet de séparer, identifier et quantifier les composés présents dans un mélange complexe. Elle est très utilisée pour les analytes thermosensibles, polaires, ou de masse molaire élevée.
Quels sont les principaux composants d’un système HPLC ?
Un système HPLC comprend un réservoir d’éluant, une pompe haute pression, un injecteur, une colonne contenant la phase stationnaire, un détecteur (comme UV-Vis ou MS), et un système d’acquisition de données.
Pourquoi la colonne HPLC est-elle en acier inoxydable ?
Elle doit résister à des pressions très élevées générées par les pompes, souvent supérieures à 1000 psi, tout en assurant une bonne stabilité chimique pour les phases stationnaires utilisées.
Quelle est la différence entre une phase normale et une phase inversée ?
En phase normale, la phase stationnaire est polaire et la phase mobile moins polaire. En phase inversée (RPLC), la phase stationnaire est apolaire et la phase mobile plus polaire, ce qui est aujourd’hui le mode le plus courant.
Quel type de composé est le mieux analysé en RPLC ?
Les composés polaires à moyennement polaires sont les mieux analysés en RPLC. Les plus hydrophobes auront une rétention plus longue, facilitant leur séparation dans une phase mobile aqueuse.
Quels types de particules sont utilisées comme support dans les colonnes HPLC ?
Principalement des particules de silice poreuse, parfois modifiées en surface (greffées), avec des tailles allant de 1,7 à 5 µm, ce qui offre un compromis entre performance et contre-pression.
Pourquoi diminue-t-on la taille des particules dans les colonnes modernes ?
Réduire la taille des particules permet d’augmenter le nombre de plateaux théoriques et donc d’obtenir des pics plus étroits et une meilleure résolution, même si cela augmente la pression nécessaire.
Qu’est-ce qu’une colonne superficiellement poreuse (‘fused-core’) ?
Il s’agit de particules avec un noyau solide et une surface poreuse. Elles offrent une excellente efficacité sans générer autant de contre-pression que les particules entièrement poreuses.
Pourquoi la porosité de la phase stationnaire est-elle importante ?
La porosité influence l’accessibilité de la surface pour l’analyte. Les petites molécules pénètrent les pores, tandis que les grosses peuvent y accéder partiellement ou pas du tout, ce qui affecte leur rétention.
Quels sont les avantages de la HPLC par rapport à la GC ?
La HPLC permet d’analyser des composés non volatils, thermosensibles ou ioniques, sans les vaporiser, ce qui la rend plus adaptée à des analytes comme les protéines, peptides, ou métabolites polaires.
Qu’est-ce que la phase stationnaire en HPLC de partage ?
C’est une couche liquide fixée à une surface solide (souvent silice greffée) dans laquelle les analytes interagissent par des forces de partage, influençant leur temps de rétention.
Quelles sont les phases stationnaires non polaires utilisées en RPLC ?
Les chaînes greffées C18 (octadécyl), C8 (octyl) et phényl sont parmi les plus utilisées. Elles interagissent fortement avec les composés hydrophobes.
Comment varie la rétention en phase inverse selon la polarité de l’analyte ?
Plus un analyte est hydrophobe, plus il interagit avec la phase stationnaire non polaire, ce qui prolonge sa rétention. Les analytes polaires sont élués plus rapidement.
Quel est le rôle des groupes fonctionnels greffés sur la silice ?
Ils permettent d’ajuster la polarité de la phase stationnaire et donc de sélectionner les interactions dominantes dans la séparation.
Pourquoi faut-il faire attention au pH avec les colonnes à base de silice ?
La silice peut se dissoudre à pH trop bas ou trop élevé, et les liaisons greffées peuvent s’hydrolyser, ce qui endommage la phase stationnaire et altère la reproductibilité.
Qu’est-ce que le mode HILIC ?
C’est un mode de chromatographie liquide où la phase stationnaire est très polaire (par exemple silice nue ou greffée diol), et la phase mobile est majoritairement organique, ce qui favorise la rétention des composés hydrophiles.
Quelle est la particularité du mode HILIC comparé au RPLC ?
Dans HILIC, les analytes polaires sont mieux retenus, contrairement au mode inverse. Il est donc complémentaire au RPLC pour séparer des composés très hydrophiles.
Pourquoi utilise-t-on plusieurs types de phases stationnaires ?
Parce que chaque type permet de cibler un type de composé selon ses propriétés chimiques : hydrophobie, polarité, charge, taille ou affinité spécifique.
Quel est l’impact d’une mauvaise adéquation entre phase stationnaire et analyte ?
Cela peut conduire à une rétention insuffisante ou excessive, à des pics mal formés, voire à l’impossibilité de détecter l’analyte.
Comment choisir une phase stationnaire adaptée ?
En considérant la nature chimique de l’analyte, son hydrophobicité, ses groupements fonctionnels, et le mode de séparation recherché (partage, adsorption, etc.).
Qu’est-ce qu’un éluant en chromatographie liquide ?
L’éluant est le solvant ou le mélange de solvants utilisé comme phase mobile. Il entraîne les analytes à travers la colonne et joue un rôle essentiel dans la séparation selon ses propriétés chimiques.
Quels solvants sont couramment utilisés en phase mobile ?
Les solvants fréquents incluent l’eau, l’acétonitrile, le méthanol, l’isopropanol, et divers mélanges. Le choix dépend de la polarité, de la compatibilité avec l’analyte et le détecteur, et de la force éluante désirée.
Qu’est-ce que la force éluante d’un solvant ?
C’est la capacité d’un solvant à déplacer un analyte de la phase stationnaire. Plus la force éluante est grande, plus l’analyte est élué rapidement.
Comment varie la force éluante en phase inversée (RPLC) ?
En RPLC, la force éluante augmente quand la polarité du solvant diminue, car la phase stationnaire est non polaire. Un solvant moins polaire déplace plus facilement les analytes hydrophobes.
