Cours 11 - Électrophorèse capillaire 2

Question 1

Qu’est-ce que la résolution en électrophorèse capillaire ?

Answer 1

La résolution représente la capacité du système à distinguer deux analytes migrés à travers le capillaire. Elle dépend de la différence de migration entre les composés et de la largeur de leurs pics respectifs. Une bonne résolution signifie que les pics sont bien séparés, sans chevauchement, ce qui permet une quantification fiable et une identification claire.

Question 2

Pourquoi la résolution est-elle importante en électrophorèse ?

Answer 2

Une bonne résolution est essentielle pour distinguer des analytes ayant des propriétés physico-chimiques très proches. Si la résolution est insuffisante, les pics peuvent se superposer, ce qui nuit à la précision de l’analyse et peut conduire à des erreurs d’interprétation.

Question 3

Quels facteurs influencent la résolution ?

Answer 3

Elle est influencée par la différence de mobilité électrophorétique entre les analytes, la largeur des pics (liée à l’efficacité), la longueur du capillaire, la tension appliquée, le pH du tampon, la température, et les interactions possibles avec des additifs ou les parois du capillaire.

Question 4

Qu’est-ce que l’efficacité d’un système électrophorétique ?

Answer 4

L’efficacité décrit la finesse des pics obtenus. Un système efficace génère des pics étroits, ce qui améliore la capacité à séparer des analytes de mobilités proches. Cela dépend principalement de la diffusion des analytes, de la régularité du champ électrique et de la qualité du capillaire.

Question 5

Pourquoi l’efficacité est-elle si élevée en électrophorèse capillaire ?

Answer 5

En raison de l’absence de phase stationnaire solide, le flux de liquide est plat (sans gradient de vitesse), ce qui réduit la dispersion des analytes. Les dimensions réduites du capillaire limitent aussi la diffusion latérale, permettant des séparations très efficaces même en quelques centimètres.

Question 6

Quels facteurs diminuent l’efficacité ?

Answer 6

Une surinjection de l’échantillon, des interactions indésirables avec la paroi du capillaire, une mauvaise maîtrise de la température, une composition de tampon inadéquate ou instable, et une mauvaise préparation des échantillons peuvent tous élargir les pics et réduire l’efficacité du système.

Question 7

Qu’est-ce que la sélectivité en électrophorèse ?

Answer 7

La sélectivité est la capacité du système à faire migrer différemment deux analytes ayant des propriétés proches. Elle dépend de leurs différences de charge, de taille, ou d’interaction avec les additifs du système, et elle peut être modulée en ajustant les conditions expérimentales.

Question 8

Comment améliorer la sélectivité ?

Answer 8

En ajustant des paramètres comme le pH, la force ionique, ou en ajoutant des agents spécifiques comme des complexants, des surfactants ou des agents chiraux, on peut induire des différences de migration plus marquées entre des analytes proches.

Question 9

Pourquoi est-il utile d’augmenter la longueur du capillaire ?

Answer 9

Un capillaire plus long permet aux analytes de migrer plus longtemps, ce qui donne plus de temps pour qu’ils se séparent. Cela peut améliorer la résolution, mais au prix d’un temps d’analyse plus long et d’un risque accru de diffusion.

Question 10

Quels compromis faut-il faire entre efficacité et temps d’analyse ?

Answer 10

Pour obtenir une meilleure séparation, on peut allonger le capillaire ou réduire la tension, mais cela augmente le temps d’analyse. À l’inverse, une analyse plus rapide peut réduire la résolution. Il faut donc ajuster les paramètres pour équilibrer performance analytique et productivité.

Question 11

Qu’est-ce que la MEKC ?

Answer 11

La MEKC (Micellar Electrokinetic Chromatography) est une technique hybride entre électrophorèse et chromatographie. Elle utilise des micelles (agrégats de tensioactifs) en solution pour séparer aussi bien des composés chargés que neutres, selon leur affinité relative pour les micelles et la phase aqueuse.

Question 12

Quel est le rôle des micelles dans la MEKC ?

Answer 12

Les micelles jouent le rôle d’une pseudo-phase stationnaire en solution. Les analytes peuvent interagir avec ces structures hydrophobes : ceux qui y restent plus longtemps migreront plus lentement, tandis que ceux qui y interagissent faiblement migrent plus vite.

Question 13

Quel type de micelle est généralement utilisé en MEKC ?

Answer 13

Le dodécylsulfate de sodium (SDS) est le tensioactif le plus utilisé. Il forme des micelles anioniques en solution aqueuse, capables d’interagir avec les analytes hydrophobes et d’introduire un mécanisme de rétention différentiel.

Question 14

Comment la MEKC permet-elle de séparer des analytes neutres ?

Answer 14

En solution libre, les analytes neutres ne migreraient pas. En MEKC, ils sont entraînés via leurs interactions hydrophobes avec les micelles qui migrent lentement vers l’anode. Selon leur affinité avec les micelles, leur vitesse de migration varie.

Question 15

Quels composés sont bien séparés par MEKC ?

Answer 15

Des composés non ionisés ou hydrophobes comme des arômes, pesticides, médicaments lipophiles, stéroïdes, etc. Elle est idéale pour les mélanges complexes comprenant des composés de polarité variée.

Question 16

Qu’est-ce que le coefficient de partage dans la MEKC ?

Answer 16

C’est une mesure de l’affinité d’un analyte pour la micelle par rapport à la phase aqueuse. Plus ce coefficient est élevé, plus l’analyte passe de temps dans la micelle et plus il est retenu, ce qui allonge son temps de migration.

Question 17

Comment moduler la sélectivité en MEKC ?

Answer 17

En ajustant le pH, la concentration du tensioactif, la température ou en ajoutant des modificateurs (comme des solvants organiques ou des agents chiraux), on peut modifier la composition et la dynamique des micelles et ainsi ajuster la séparation.

Question 18

Quel est l’effet de la concentration de SDS ?

Answer 18

En dessous d’une certaine concentration (CMC), les micelles ne se forment pas. Au-dessus, plus il y a de micelles, plus les analytes peuvent y interagir, augmentant la rétention et la capacité de séparation, mais aussi la complexité de la méthode.

Question 19

Pourquoi la MEKC est-elle considérée comme très polyvalente ?

Answer 19

Elle permet de séparer des composés neutres et ioniques dans un seul système, ce qui n’est pas possible avec l’électrophorèse capillaire classique. Elle offre aussi des possibilités d’adaptation par modification chimique de la phase micellaire.

Question 20

Comment la MEKC peut-elle séparer des énantiomères ?

Answer 20

En ajoutant des modificateurs chiraux (comme des cyclodextrines) qui interagissent différemment avec chaque énantiomère, ce qui génère une différence de temps de migration entre les deux formes optiques.

Question 21

Qu’est-ce que la CGE (électrophorèse sur gel capillaire) ?

Answer 21

La CGE est une technique d’électrophorèse où le capillaire est rempli d’un gel polymère qui sert de tamis moléculaire. Elle permet de séparer des molécules comme les acides nucléiques ou les protéines principalement selon leur taille, en imitant les propriétés d’un gel de polyacrylamide dans un format capillaire.

Question 22

Quel est le rôle du gel polymère dans la CGE ?

Answer 22

Le gel forme une matrice tridimensionnelle dans laquelle les analytes doivent migrer. Les plus petites molécules se déplacent plus facilement à travers les mailles du gel, tandis que les plus grosses sont ralenties. Cela permet une séparation très précise selon la taille.

Question 23

Quels types d’analytes sont séparés par CGE ?

Answer 23

On utilise la CGE principalement pour séparer des biomolécules comme les fragments d’ADN, d’ARN ou les protéines. Elle est largement employée dans les laboratoires de biologie moléculaire, notamment pour le séquençage, le génotypage ou la vérification de pureté.

Question 24

Quels sont les avantages de la CGE par rapport à la PAGE classique ?

Answer 24

La CGE est automatisée, consomme moins d’échantillon, offre une meilleure reproductibilité, et permet une détection directe dans le capillaire. Elle réduit aussi les temps d’analyse et supprime le besoin de coloration post-séparation.

Question 25

Comment se présente le gel dans la CGE ?

Answer 25

Le gel est généralement un polymère en solution, non réticulé, qui peut être facilement injecté et remplacé entre les analyses. Cela permet un entretien facile et évite les contaminations croisées entre échantillons.

Question 26

Pourquoi la température doit-elle être bien contrôlée en CGE ?

Answer 26

La viscosité du gel est sensible à la température, ce qui influence la vitesse de migration des analytes. Une température stable est donc essentielle pour obtenir des résultats reproductibles et des pics bien définis.

Question 27

Comment le gel est-il introduit dans le capillaire ?

Answer 27

Il est injecté soit par pression, soit par aspiration sous vide. Le processus est automatisé dans la plupart des instruments, permettant un remplissage uniforme et reproductible.

Question 28

Pourquoi la CGE est-elle utile pour le séquençage d’ADN ?

Answer 28

Parce qu’elle permet de séparer des fragments d’ADN qui ne diffèrent que d’un seul nucléotide, ce qui est indispensable pour les applications de séquençage à haute résolution et de contrôle de qualité en génomique.

Question 29

Quels sont les types de gels utilisés en CGE ?

Answer 29

On utilise principalement des polymères comme le polyacrylamide non réticulé ou des mélanges de polymères hydrophiles. Ces gels sont choisis en fonction de la taille des analytes à séparer et de leur nature chimique.

Question 30

Quel est l’intérêt des polymères à usage unique ?

Answer 30

Les polymères à usage unique permettent de réduire les risques de contamination, d’éliminer le besoin de régénération du gel et de garantir des conditions identiques d’une analyse à l’autre, ce qui est essentiel pour les applications cliniques ou réglementées.

Question 31

Qu’est-ce que la CITP (Capillary Isotachophoresis) ?

Answer 31

La CITP est une technique de séparation basée sur l’empilement de zones d’électrolytes. Les analytes sont concentrés entre un électrolyte leader (à haute mobilité) et un électrolyte terminator (à faible mobilité). Chaque analyte forme une zone nette et migre à la même vitesse que le champ électrique, ce qui permet une séparation et une préconcentration très efficaces.

Question 32

Qu’est-ce que la CIEF (Capillary Isoelectric Focusing) ?

Answer 32

La CIEF est utilisée pour séparer les analytes, en particulier les protéines, selon leur point isoélectrique (pI). Les analytes migrent dans un gradient de pH jusqu’à atteindre le pH où leur charge nette est nulle. À ce point, ils s’immobilisent, ce qui permet une séparation extrêmement fine basée uniquement sur le pI.

Question 33

Qu’est-ce que la CEC (Chromatographie Électrocinétique Capillaire) ?

Answer 33

La CEC combine les principes de la chromatographie et de l’électrophorèse. Une phase stationnaire est fixée dans le capillaire (comme en chromatographie), mais la migration des analytes est assurée par le flux électro-osmotique généré par le champ électrique, ce qui permet des séparations très efficaces sans pression.

Question 34

Quels types de détecteurs peut-on utiliser en électrophorèse capillaire ?

Answer 34

Les détecteurs les plus courants sont l’absorbance UV/Visible, la fluorescence, la conductivité et la spectrométrie de masse (MS). Le choix dépend de la nature chimique des analytes, de la matrice, et de la sensibilité nécessaire.

Question 35

Comment fonctionne la détection UV dans l’EC ?

Answer 35

Elle repose sur l’absorbance de la lumière par les analytes à une longueur d’onde donnée, en général dans l’UV. Lorsque les analytes passent devant le détecteur, ils absorbent la lumière, ce qui génère un signal proportionnel à leur concentration.

Question 36

Quels sont les avantages de la détection UV ?

Answer 36

Cette méthode est simple, peu coûteuse, robuste, et compatible avec la majorité des analytes possédant des groupements chromophores. Elle est aussi bien intégrée dans les systèmes automatisés.

Question 37

Quels sont les inconvénients de la détection UV ?

Answer 37

Elle n’est pas adaptée aux composés sans chromophore, et peut être affectée par l’absorbance du tampon ou du solvant. De plus, elle offre une sensibilité moyenne comparée à d’autres méthodes comme la fluorescence.

Question 38

Qu’est-ce que la détection par fluorescence ?

Answer 38

Elle consiste à exciter les analytes avec une source lumineuse et à mesurer la lumière qu’ils émettent en retour. Elle nécessite que les analytes soient naturellement fluorescents ou aient été préalablement marqués.

Question 39

Quand utilise-t-on la fluorescence en électrophorèse capillaire ?

Answer 39

On l’utilise lorsqu’on travaille avec des quantités très faibles d’analytes, comme dans l’analyse de protéines ou de peptides marqués, ou lorsque la matrice est complexe et que la sélectivité est nécessaire.

Question 40

Quels sont les avantages de la détection par fluorescence ?

Answer 40

Elle offre une sensibilité très élevée, souvent jusqu’à 1000 fois supérieure à l’UV, avec une excellente sélectivité. Elle est particulièrement adaptée aux analyses en trace et aux applications biologiques.

Question 41

Qu’est-ce que la détection par conductivité ?

Answer 41

Elle mesure la variation de conductivité ionique entre le fond du tampon et la zone contenant l’analyte. Cette méthode est utile pour les composés ioniques sans chromophores, comme les sels ou les petites molécules inorganiques.

Question 42

Qu’est-ce que la spectrométrie de masse couplée à l’EC (CE-MS) ?

Answer 42

C’est une méthode très puissante combinant l’électrophorèse capillaire avec l’identification et la quantification des analytes par leur masse. Elle permet une grande sensibilité et une spécificité inégalée, même dans des matrices complexes.

Question 43

Quels sont les défis associés à la CE-MS ?

Answer 43

Il faut adapter la composition du tampon pour qu’il soit compatible avec l’ionisation (souvent ESI), gérer les faibles débits du capillaire et éviter les interférences de fond. Une optimisation fine des conditions est souvent nécessaire.

Question 44

Pourquoi le choix du tampon est-il crucial en électrophorèse capillaire ?

Answer 44

Le tampon influence directement la séparation en déterminant le pH, la force ionique, la conductivité et l’électro-osmose. Il stabilise aussi la charge des analytes et maintient un environnement électriquement conducteur constant durant l’analyse.

Question 45

Quels critères faut-il respecter pour choisir un bon tampon ?

Answer 45

Il doit avoir un pKa proche du pH cible, une bonne capacité tampon, une faible absorbance UV si une détection UV est utilisée, et ne pas interagir avec les analytes. Il doit aussi rester stable à la température de travail.

Question 46

Quels additifs peut-on utiliser pour moduler la séparation ?

Answer 46

On peut ajouter des agents complexants (comme l’EDTA pour les ions métalliques), des surfactants (comme le SDS en MEKC), des modificateurs chiraux (cyclodextrines), ou des solvants organiques (comme l’acétonitrile) pour ajuster la sélectivité et la mobilité des analytes.

Question 47

Quel est l’effet des solvants organiques comme l’acétonitrile dans le tampon ?

Answer 47

Ils modifient la viscosité, la polarité, et parfois l’ionisation des analytes. Cela peut affecter leur mobilité, améliorer la résolution, ou stabiliser certains analytes sensibles à l’eau ou au pH.

Question 48

Pourquoi utilise-t-on des modificateurs chiraux dans le tampon ?

Answer 48

Les modificateurs chiraux permettent de différencier des énantiomères, en introduisant des interactions spécifiques avec chacun d’eux. Cela permet leur séparation même lorsqu’ils ont les mêmes propriétés physico-chimiques globales.

Question 49

Quel est le rôle du SDS lorsqu’il est utilisé en dehors de la MEKC ?

Answer 49

Même en solution libre, le SDS peut interagir avec des analytes hydrophobes ou légèrement polaires, formant des associations transitoires qui modifient leur migration et permettent une meilleure sélectivité.

Question 50

Comment le tampon influence-t-il le courant électrique dans le capillaire ?

Answer 50

Un tampon trop concentré génère un courant excessif, produisant de la chaleur et risquant de dégrader les pics. À l’inverse, un tampon trop dilué donne un courant instable, affectant la reproductibilité.

Question 51

Pourquoi faut-il contrôler la température lors des analyses ?

Answer 51

La température influence la viscosité du tampon, la mobilité des analytes et la stabilité du courant. Des variations peuvent modifier les temps de migration, causant une perte de précision dans les résultats.

Question 52

Que sont les additifs non ioniques, et quel est leur intérêt ?

Answer 52

Ce sont des molécules qui n’interviennent pas directement dans la conduction électrique mais qui modifient les interactions entre analytes ou avec les parois du capillaire. Ils peuvent améliorer la forme des pics et réduire les interactions non spécifiques.

Question 53

Comment un tampon mal choisi peut-il affecter la séparation ?

Answer 53

Un mauvais tampon peut fausser l’ionisation des analytes, perturber le flux électro-osmotique ou interférer avec la détection. Cela peut conduire à des pics asymétriques, des chevauchements ou une perte de résolution.

Question 54

Quels analytes peuvent être séparés en solution libre ?

Answer 54

Tous les composés ionisables : ions inorganiques, acides aminés, peptides, petites molécules organiques, acides nucléiques. Leur séparation repose uniquement sur leur mobilité électrophorétique dans le champ électrique appliqué.

Question 55

Quels sont les avantages de la séparation en solution libre ?

Answer 55

Elle permet des séparations très rapides, sans nécessité de phase stationnaire ou d’additifs, avec une efficacité très élevée. Elle est particulièrement adaptée à des analytes chargés simples ou à des mélanges ioniques.

Question 56

Quels sont les inconvénients de la séparation en solution libre ?

Answer 56

Elle ne permet pas la séparation des analytes neutres, sauf s’ils sont modifiés ou associés à une pseudo-phase comme dans MEKC. La sélectivité est parfois limitée pour les composés de mobilités similaires.

Question 57

Comment adapter la séparation libre à des échantillons complexes ?

Answer 57

En ajustant finement le pH, en ajoutant des agents complexants ou modificateurs sélectifs, et en utilisant des capillaires modifiés pour éviter les interactions non spécifiques. La qualité du tampon est aussi essentielle.

Question 58

Que signifie “empilement des zones” (stacking) ?

Answer 58

C’est une technique de préconcentration électrocinétique dans laquelle une discontinuité de conductivité est utilisée pour concentrer les analytes au début du capillaire. Cela permet d’augmenter la sensibilité sans modifier le système de séparation.

Question 59

Quels paramètres doivent être rigoureusement contrôlés pour garantir la reproductibilité ?

Answer 59

Le pH, la température, la composition et la concentration du tampon, la propreté du capillaire, les conditions d’injection, et la tension appliquée. Même de petites variations peuvent modifier les résultats.

Question 60

Pourquoi l’électrophorèse capillaire est-elle une technique de haute performance ?

Answer 60

Parce qu’elle combine une très haute efficacité, une faible consommation d’échantillon et de solvants, une automatisation facile, et une compatibilité avec des détections très sensibles. Elle est adaptée aux analyses de routine comme à la recherche avancée.