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BCM 2971 > Cours 3 - Spectrométrie de masse 2 > Flashcards

Cours 3 - Spectrométrie de masse 2 Flashcards

1
Q

Quel rôle joue la phosphorylation dans la cellule ?

A

La phosphorylation est un mécanisme essentiel de régulation cellulaire. Elle modifie l’activité, la conformation ou les interactions des protéines en ajoutant un groupement phosphate, influençant ainsi des processus comme la signalisation, la prolifération ou le métabolisme.

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2
Q

Quels acides aminés sont les principales cibles de phosphorylation ?

A

Les acides aminés sérine (Ser) et thréonine (Thr) représentent plus de 99 % des cas. La tyrosine (Tyr) est moins fréquente mais cruciale dans certaines voies de signalisation.

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3
Q

Quelle enzyme catalyse l’ajout du groupement phosphate ?

A

Les kinases catalysent le transfert d’un phosphate de l’ATP vers un groupement hydroxyle d’un acide aminé cible (Ser, Thr ou Tyr).

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4
Q

Quelle enzyme retire un groupement phosphate d’une protéine ?

A

Les phosphatases retirent le groupement phosphate ajouté par les kinases, assurant un contrôle dynamique et réversible de la phosphorylation.

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5
Q

Pourquoi la phosphorylation est-elle considérée comme dynamique ?

A

Parce qu’elle résulte d’un équilibre réversible entre kinases et phosphatases, permettant une modulation rapide de l’activité protéique selon des signaux cellulaires.

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6
Q

Quelle proportion du génome code pour des kinases ?

A

Environ 5 % du génome humain code pour des kinases, soit environ 518 gènes, ce qui souligne leur importance dans la régulation cellulaire.

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7
Q

Quelle est l’abondance des protéines phosphorylées dans une cellule ?

A

Environ un tiers des protéines sont phosphorylées à un moment donné, ce qui reflète l’ampleur de ce mécanisme de régulation.

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8
Q

Qu’est-ce qu’un phosphoprotéome ?

A

C’est l’ensemble des protéines phosphorylées présentes dans une cellule à un moment donné. Il varie selon l’état cellulaire ou pathologique.

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9
Q

Pourquoi la détection des phosphoprotéines est-elle un défi ?

A

Parce qu’elles sont en faible abondance, parfois instables, et leur signal peut être masqué par les peptides non modifiés sans enrichissement préalable.

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10
Q

Qu’est-ce que la variation de stoichiométrie en phosphorylation ?

A

Cela désigne le fait que toutes les copies d’une même protéine ne sont pas phosphorylées au même site ou moment, complexifiant l’analyse par MS.

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11
Q

Pourquoi enrichit-on les phosphopeptides avant MS ?

A

Parce qu’ils représentent une faible fraction des peptides totaux. L’enrichissement augmente leur concentration relative, facilitant leur détection par MS.

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12
Q

Quels sont les deux types de stratégie d’enrichissement courants ?

A

L’utilisation de TiO₂, qui capte les peptides riches en Ser/Thr, et l’IMAC, qui cible particulièrement les peptides phosphorylés sur Tyr.

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13
Q

Comment fonctionne l’enrichissement au TiO₂ ?

A

Le TiO₂ retient les phosphopeptides par interactions électrostatiques et liaisons hydrogène, séparant efficacement les peptides phosphorylés des non modifiés.

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14
Q

Pourquoi utilise-t-on parfois une méthylation avant IMAC ?

A

Pour neutraliser les résidus acides (Asp, Glu) qui pourraient se lier non spécifiquement, augmentant ainsi la spécificité de l’enrichissement des phosphopeptides.

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15
Q

Qu’est-ce qu’un anticorps anti-phosphotyrosine ?

A

C’est un anticorps spécifique qui reconnaît les résidus de tyrosine phosphorylés, utilisé pour enrichir sélectivement les phosphopeptides portant ce type de modification.

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16
Q

Quels métaux sont utilisés en IMAC ?

A

Le fer (Fe³⁺) et le gallium (Ga³⁺) sont couramment utilisés pour leur affinité élevée avec les groupes phosphate des peptides.

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17
Q

Quels types de peptides sont mieux captés par TiO₂ ?

A

Les peptides monophosphorylés sur Ser ou Thr sont mieux captés par TiO₂. Les peptides multiphosphorylés nécessitent parfois des ajustements spécifiques.

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18
Q

Quels sont les avantages de l’utilisation combinée de TiO₂ et IMAC ?

A

La combinaison permet de couvrir plus largement le phosphoprotéome, TiO₂ ciblant Ser/Thr et IMAC étant plus adapté aux Tyr phosphorylés.

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19
Q

Pourquoi l’enrichissement est-il une étape critique ?

A

Sans enrichissement, les phosphopeptides seraient noyés dans les peptides non modifiés, compromettant leur détection par MS.

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20
Q

Comment valide-t-on l’efficacité de l’enrichissement ?

A

En comparant le nombre de peptides phosphorylés identifiés avant et après enrichissement, ou par analyse comparative des spectres MS/MS.

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21
Q

Qu’est-ce que la fragmentation MS/MS ?

A

La fragmentation MS/MS consiste à isoler un ion précurseur (peptide), à le fragmenter pour générer des ions fragments, et à analyser ces derniers afin de déduire la séquence du peptide.

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22
Q

Pourquoi utilise-t-on la dissociation par collision (CID) ?

A

La CID permet de fragmenter les peptides au niveau des liaisons peptidiques, produisant des ions b et y utiles pour le séquençage.

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23
Q

Quels sont les principaux types d’ions générés en MS/MS ?

A

Les ions de type b (N-terminal) et y (C-terminal) sont les plus fréquents. Leur analyse permet d’identifier la séquence du peptide.

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24
Q

Pourquoi les ions a, b et y sont-ils importants ?

A

Ils résultent de cassures spécifiques des liaisons peptidiques, permettant une lecture directe de la séquence à partir des différences de masse.

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25
Qu’est-ce qu’un spectre MS/MS ?
C’est une représentation des intensités des ions fragments selon leur rapport m/z, générée à partir de la fragmentation contrôlée d’un peptide.
26
Comment interpréter un spectre MS/MS ?
En observant les différences de masse entre pics successifs d’ions b ou y, ce qui permet de reconstituer la séquence du peptide.
27
Pourquoi certains ions peuvent-ils être absents du spectre ?
À cause de la stabilité des fragments, de la séquence du peptide ou d’une faible efficacité de fragmentation à certains endroits.
28
Quel est l’impact de la phosphorylation sur la fragmentation ?
Elle peut provoquer des pertes neutres (H₃PO₄ ou HPO₃), créant des pics secondaires à interpréter correctement.
29
Quels types de pertes neutres sont fréquents pour les phosphopeptides ?
Les pertes de 98 Da (H₃PO₄) ou 80 Da (HPO₃), visibles comme des pics secondaires dans le spectre MS/MS.
30
Pourquoi la position du site phosphorylé peut-elle être difficile à déterminer ?
Parce que les fragments nécessaires à la localisation peuvent être absents ou faibles, rendant l’assignation incertaine.
31
Qu’est-ce que le 'site assignment' en MS/MS ?
C’est l’identification précise du résidu portant la modification, basée sur les fragments entourant la modification dans le spectre.
32
Comment améliorer la localisation d’un site phosphorylé ?
En augmentant la résolution, en utilisant des méthodes de fragmentation alternatives comme ETD, ou en obtenant des fragments couvrant toute la séquence.
33
Pourquoi la MS/MS est-elle puissante pour la protéomique ?
Elle permet d’identifier les peptides et leurs modifications post-traductionnelles avec une grande précision.
34
Que représente une série complète d’ions b ou y ?
Une série complète permet de déterminer toute la séquence du peptide, assurant une identification plus fiable.
35
Pourquoi observe-t-on parfois des ions de faible intensité ?
Ils peuvent être peu stables, mal formés ou présents en faible quantité, rendant leur détection plus difficile.
36
Qu’est-ce qu’une base de données de peptides ?
Un répertoire de séquences protéiques théoriques utilisé pour faire correspondre les spectres MS/MS aux séquences connues.
37
Pourquoi utilise-t-on des moteurs de recherche comme Mascot ou Sequest ?
Pour comparer automatiquement les spectres expérimentaux à des spectres théoriques et identifier les peptides présents.
38
Quelles informations sont extraites par Mascot/Sequest ?
La séquence peptidique, la masse, le score de correspondance, les fragments observés et les modifications comme la phosphorylation.
39
Pourquoi un bon score Mascot est-il important ?
Il indique une forte probabilité que le peptide identifié corresponde bien au spectre observé, renforçant la fiabilité des résultats.
40
Que représente le site probability dans les moteurs de recherche ?
La probabilité que la modification, comme la phosphorylation, soit correctement assignée à un résidu spécifique.
41
Pourquoi la redondance des séquences est-elle un problème ?
Des peptides identiques peuvent appartenir à plusieurs protéines homologues, rendant difficile leur attribution. Cela nécessite l’usage d’algorithmes de regroupement.
42
Qu’est-ce qu’un 'peptide unique' ?
C’est un peptide spécifique à une seule protéine, utilisé pour identifier cette protéine de manière non ambiguë.
43
Comment distingue-t-on plusieurs isoformes protéiques ?
Par des peptides spécifiques à chaque isoforme, souvent nécessitant une bonne couverture peptidique ou une approche ciblée.
44
Pourquoi faut-il valider les identifications MS/MS ?
Pour limiter les faux positifs générés par les moteurs de recherche. Une validation manuelle ou statistique est nécessaire.
45
Qu’est-ce que la FDR (False Discovery Rate) ?
La FDR est le pourcentage estimé de fausses identifications parmi les résultats. Elle est généralement fixée à 1 %.
46
Comment réduit-on la FDR dans les analyses complexes ?
En utilisant des bases décoy, des seuils de score rigoureux, et une combinaison de critères statistiques.
47
Pourquoi la spectrométrie de masse est-elle utile en recherche biomédicale ?
Elle permet de détecter des biomarqueurs, suivre des modifications post-traductionnelles et comprendre des mécanismes pathologiques avec précision.
48
Quel est l’intérêt d’étudier les sites de phosphorylation ?
Ils révèlent des mécanismes de régulation cellulaire et peuvent devenir des cibles thérapeutiques en cas de dérèglement.
49
Pourquoi le contexte biologique des protéines identifiées est-il important ?
Parce qu’il permet d’interpréter les fonctions et interactions des protéines dans un cadre physiologique ou pathologique.
50
Comment visualise-t-on les résultats de spectrométrie ?
Par des logiciels dédiés affichant spectres MS/MS, couverture peptidique, cartes de modifications et liens vers des bases fonctionnelles.
51
Pourquoi utilise-t-on des contrôles dans les expériences MS ?
Pour vérifier la qualité des données, identifier les biais expérimentaux et assurer la reproductibilité.
52
Comment la quantification relative est-elle réalisée ?
Par comparaison d’intensité ou par des balises isotopiques (ex. : TMT, SILAC) analysées simultanément.
53
Pourquoi la quantification absolue est-elle plus complexe ?
Elle requiert des standards internes connus et une calibration précise, les réponses variant selon les peptides et la matrice.
54
Comment valider un site de phosphorylation en dehors de la MS ?
Par mutation dirigée, anticorps spécifiques, western blot ou imagerie pour confirmer la localisation et la fonction.
55
Quel est l’intérêt de combiner MS avec d’autres approches omiques ?
Cela offre une vue intégrée des régulations biologiques en croisant les données transcriptomiques, protéomiques et métabolomiques.
56
Pourquoi les données MS sont-elles archivées dans des bases publiques ?
Pour garantir la transparence, la validation par la communauté et la réutilisation scientifique des données.
57
Comment la MS est-elle utilisée en médecine personnalisée ?
Elle permet de caractériser des profils moléculaires spécifiques à chaque patient, utiles pour adapter les traitements.
58
Quels sont les défis actuels en phosphoprotéomique ?
La faible abondance, la complexité des échantillons, la redondance et la localisation ambiguë des sites de phosphorylation.
59
Comment améliorer la couverture du phosphoprotéome ?
En combinant enrichissements, fractionnement, techniques de fragmentation variées et analyses bioinformatiques avancées.
60
Quelle est la limite principale de la MS pour les modifications dynamiques ?
Ces modifications sont souvent instables, transitoires et peu abondantes, rendant leur détection difficile sans stratégies adaptées.

BCM 2971 (14 decks)

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