Cours 10 - Électrophorèse capillaire 1 Flashcards
Qu’est-ce que l’électrophorèse ?
L’électrophorèse est une technique d’analyse utilisée pour séparer des particules chargées, comme des protéines ou des acides nucléiques, en les faisant migrer sous l’effet d’un champ électrique. La vitesse de migration dépend principalement de la charge de la molécule, de sa taille, et de la viscosité du milieu. Elle est largement utilisée en biochimie et en biologie moléculaire pour caractériser ou purifier des biomolécules.
Quels sont les deux types principaux d’électrophorèse ?
Il existe deux grandes catégories : l’électrophorèse classique, généralement réalisée sur gel (comme l’agarose ou le polyacrylamide), et l’électrophorèse capillaire, qui se déroule dans un capillaire en silice rempli de tampon. La première est plus simple et visuelle, tandis que la seconde est plus rapide, automatisable et analytique.
Quels gels sont utilisés en électrophorèse classique ?
Le gel d’agarose est surtout utilisé pour séparer des acides nucléiques (ADN, ARN) en raison de ses grands pores. Le gel de polyacrylamide, quant à lui, est utilisé pour les protéines car ses pores sont plus fins, permettant une meilleure discrimination selon la taille. Le choix du gel dépend donc de la taille des molécules à analyser.
Quelle est la particularité du SDS-PAGE ?
Le SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) est une technique où les protéines sont d’abord dénaturées et recouvertes de SDS, un détergent anionique. Celui-ci confère une charge négative uniforme aux protéines, masquant leur charge native. Ainsi, la séparation se fait uniquement en fonction de leur masse moléculaire, ce qui permet une analyse précise.
Que signifie 1D-PAGE ?
Il s’agit d’une électrophorèse unidimensionnelle sur gel de polyacrylamide, où les protéines sont séparées selon un seul paramètre : leur masse moléculaire. Cette méthode est la plus utilisée pour l’analyse de mélanges simples ou pour suivre une purification.
Qu’est-ce que 2D-PAGE ?
La 2D-PAGE est une méthode plus sophistiquée qui combine deux techniques en série : d’abord une séparation selon le point isoélectrique (pI) par focalisation isoélectrique (IEF), puis une séparation selon la masse moléculaire par SDS-PAGE. Cela permet une résolution très élevée, capable de séparer plusieurs centaines de protéines sur un seul gel.
Pourquoi utilise-t-on le SDS dans l’électrophorèse des protéines ?
Le SDS permet de dénaturer les protéines (en déroulant leur structure tertiaire et quaternaire) et leur confère une charge négative proportionnelle à leur longueur. Cela supprime les différences de charge native et de forme, rendant la migration dépendante uniquement de la taille de la protéine.
Quelles méthodes permettent de visualiser les protéines après électrophorèse ?
Les méthodes les plus utilisées sont la coloration au bleu de Coomassie (rapide, peu sensible), la coloration au nitrate d’argent (plus sensible, mais plus lente), et les colorants fluorescents (haute sensibilité, quantitatifs, compatibles avec des logiciels d’analyse d’image).
Qu’est-ce que la focalisation isoélectrique (IEF) ?
C’est une technique de séparation basée sur le point isoélectrique (pI) des protéines, qui correspond au pH où elles n’ont plus de charge nette. Dans un gradient de pH appliqué à un champ électrique, les protéines migrent jusqu’à ce qu’elles atteignent leur pI, où elles s’immobilisent, car elles ne sont plus attirées vers aucune électrode.
Comment la masse moléculaire influence-t-elle la migration dans un gel ?
Plus la protéine est grosse, plus elle migre lentement dans le gel, car elle rencontre plus de résistance à travers les pores du gel. La relation est souvent logarithmique : une petite variation de masse peut provoquer une grande différence de migration sur le gel.
Qu’est-ce que l’électrophorèse capillaire (EC) ?
C’est une technique de séparation très performante dans laquelle les analytes migrent dans un capillaire rempli de tampon, sous l’action d’un champ électrique. La séparation repose principalement sur la différence de mobilité électrophorétique des analytes, sans phase stationnaire. Cela permet des séparations rapides et efficaces, même pour des molécules similaires.
Quels sont les principaux avantages de l’électrophorèse capillaire ?
Elle combine une très haute efficacité de séparation, une faible consommation d’échantillon et de solvant, et un temps d’analyse court. Elle permet également l’automatisation et offre une excellente reproductibilité, tout en étant compatible avec la détection UV, fluorescence ou masse.
Quels sont les modes d’électrophorèse capillaire ?
Il existe plusieurs sous-modes selon le mécanisme de séparation : FSCE ou CZE (en solution libre), MEKC (chromatographie micellaire), CGE (sur gel), CIEF (focalisation isoélectrique), CITP (zonale) et CEC (chromatographie électrocinétique). Chaque mode est adapté à un type d’analyte ou de séparation spécifique.
Quel est le principe de la séparation en solution libre (CZE/FSCE) ?
Les analytes migrent à travers le tampon uniquement selon leur charge et leur taille. La séparation est donc basée sur leur mobilité électrophorétique, sans l’influence d’une phase stationnaire ou d’un agent de rétention.
Pourquoi utilise-t-on des capillaires de silice fondue ?
Parce que leur surface négative permet la formation d’une double couche électrique responsable de l’électro-osmose. De plus, la silice est stable, résistante à la pression et transparente aux UV, ce qui facilite la détection directe.
Quel est l’intérêt d’un champ électrique élevé dans l’EC ?
L’application d’un champ intense (souvent 10 à 30 kV) accélère la migration des analytes, réduisant le temps d’analyse tout en maintenant une bonne efficacité. Cela permet également de réduire l’effet de diffusion.
Pourquoi l’EC est-elle bien adaptée aux biomolécules ?
Parce qu’elle se fait en phase aqueuse, sans solvant organique agressif ni support solide qui pourrait interagir ou dénaturer les biomolécules. Elle est donc idéale pour les peptides, protéines, acides nucléiques et métabolites.
En quoi l’EC diffère-t-elle fondamentalement de la chromatographie ?
En chromatographie, les analytes sont retenus sur une phase stationnaire et séparés selon leur affinité pour celle-ci. En EC, il n’y a pas de rétention au sens classique : la séparation repose uniquement sur la mobilité dans un champ électrique.
Quels types d’analytes peuvent être séparés en CZE ?
Les acides aminés, peptides, petites molécules organiques, acides nucléiques, ions, voire protéines partiellement repliées. En général, tout analyte chargé peut être séparé par cette méthode.
Pourquoi les volumes d’échantillon sont-ils si faibles en EC ?
Parce que les capillaires sont très fins (souvent moins de 75 µm de diamètre), une injection de 1 à 20 nL suffit. Cela limite la dilution des analytes et permet une détection rapide et sensible, sans saturer le système.
Qu’est-ce que la mobilité électrophorétique ?
C’est la vitesse de migration d’un ion dans un champ électrique. Elle dépend directement de la charge de l’ion et inversement de sa taille et de la viscosité du tampon. Les ions petits et fortement chargés migrent plus rapidement.
Pourquoi dit-on que la séparation en EC est basée sur le rapport charge/masse ?
Car ce rapport influence la vitesse de migration. Deux ions de même taille mais de charges différentes migreront à des vitesses différentes, et inversement, deux ions de même charge mais de tailles différentes auront aussi des vitesses différentes.
Qu’est-ce que l’électro-osmose dans un capillaire ?
C’est le mouvement global du liquide à l’intérieur du capillaire induit par le champ électrique. Il se produit parce que les parois du capillaire sont chargées négativement et attirent des cations qui forment une couche mobile entraînée vers la cathode.
Pourquoi l’électro-osmose est-elle essentielle en EC ?
Elle permet de faire migrer tous les analytes, même les neutres ou les anions, vers la détection. Sans électro-osmose, seuls les cations atteindraient le détecteur dans un temps raisonnable.
