Cours 12 - Méthodes spectroscopiques Flashcards
Qu’est-ce que la spectroscopie ?
La spectroscopie est une technique analytique qui étudie les interactions entre la lumière (ou rayonnement électromagnétique) et la matière. Elle permet de déterminer des informations qualitatives ou quantitatives sur la structure, la composition ou la concentration de substances en fonction de leur comportement lorsqu’elles absorbent, émettent ou diffusent la lumière.
Comment l’énergie d’un photon est-elle liée à sa fréquence ?
L’énergie d’un photon est directement proportionnelle à sa fréquence : plus la fréquence est élevée, plus l’énergie est grande. Elle est exprimée par la relation E=hν, où h est la constante de Planck et ν la fréquence du rayonnement.
Comment sont reliées fréquence et longueur d’onde ?
La fréquence ν est inversement proportionnelle à la longueur d’onde λ. Elles sont reliées par ν=c/λ, où c est la vitesse de la lumière. Une courte longueur d’onde correspond donc à une fréquence (et une énergie) plus élevée.
À quoi correspond le nombre d’onde en spectroscopie ?
Le nombre d’onde (ν) est défini comme l’inverse de la longueur d’onde exprimée en centimètres. Il s’exprime en cm−1 et est couramment utilisé dans les spectres infrarouges pour exprimer l’énergie absorbée.
Quelle est la plage de longueurs d’onde couvertes par l’UV et le visible ?
Le domaine UV s’étend de 190 à 400 nm et le domaine visible de 400 à 800 nm. Ces gammes correspondent à des énergies suffisantes pour exciter les électrons de valence des molécules organiques.
Que signifie l’absorption d’un photon par une molécule ?
Cela signifie que la molécule capte l’énergie du photon, ce qui provoque l’excitation d’un électron vers un état énergétique supérieur. Cette absorption n’a lieu que si l’énergie du photon correspond exactement à la différence entre deux niveaux électroniques de la molécule.
Quelle est la différence entre absorption et émission ?
L’absorption correspond au passage d’un électron vers un niveau d’énergie plus élevé (état excité), alors que l’émission correspond au retour de cet électron vers un niveau plus bas, avec émission d’un photon. L’absorption précède souvent un phénomène d’émission comme la fluorescence.
Qu’est-ce que la fluorescence ?
C’est l’émission de lumière par une molécule précédemment excitée par absorption de lumière. Elle se produit rapidement après l’excitation, typiquement en quelques nanosecondes, et à une longueur d’onde plus grande que celle de l’excitation.
En quoi consiste la chimiluminescence ?
Contrairement à la fluorescence, la chimiluminescence n’a pas besoin de lumière pour exciter la molécule : l’excitation provient d’une réaction chimique. C’est ce processus qui est à la base de nombreux tests biologiques ou environnementaux sensibles.
Comment se manifeste la diffraction en spectroscopie ?
La diffraction correspond à la déviation d’une onde lorsqu’elle rencontre un obstacle ou une fente. En spectroscopie, ce phénomène est utilisé dans les réseaux pour séparer la lumière en ses différentes longueurs d’onde.
Qu’est-ce qu’une transition électronique ?
C’est le passage d’un électron d’un niveau d’énergie à un autre au sein d’une molécule. Cela nécessite que l’énergie du photon absorbé corresponde à la différence d’énergie entre les niveaux impliqués dans la transition.
Quels types d’orbitales sont impliqués dans les transitions électroniques ?
Les électrons peuvent transiter entre des orbitales liante (σ,π), non liante (n), et anti-liante (σ∗,π∗). Les transitions courantes observées sont π→π∗ et n→π∗, souvent visibles en UV.
Qu’est-ce qu’un chromophore ?
Un chromophore est une partie d’une molécule qui absorbe la lumière dans le domaine UV-visible grâce à la présence de doubles liaisons conjuguées ou d’électrons non liants. C’est le groupe responsable de la couleur de certaines molécules.
Comment la conjugaison influence-t-elle l’absorption ?
Une chaîne conjuguée plus longue abaisse l’écart d’énergie entre les orbitales moléculaires, ce qui déplace le maximum d’absorption vers des longueurs d’onde plus grandes. On parle de déplacement bathochrome.
Pourquoi les acides aminés aromatiques absorbent-ils dans l’UV ?
Leurs cycles aromatiques possèdent des systèmes π conjugués qui facilitent les transitions électroniques π→π∗. Cela explique leur absorption notable entre 250 et 280 nm.
Quels sont les λmax typiques des acides aminés Trp, Tyr et Phe ?
Le tryptophane absorbe autour de 280 nm, la tyrosine autour de 274 nm et la phénylalanine autour de 257 nm. Ces différences sont dues à leur structure aromatique respective et au type de transition impliquée.
Comment se présente le spectre d’absorption de l’albumine sérique (BSA) ?
Il présente un pic principal autour de 280 nm attribué aux acides aminés aromatiques, et une autre bande dans l’UV profond (190–210 nm) due aux liaisons peptidiques présentes dans la chaîne principale de la protéine.
Pourquoi la mesure à 280 nm permet-elle d’estimer la concentration en protéines ?
À cette longueur d’onde, les acides aminés aromatiques, en particulier le tryptophane et la tyrosine, absorbent fortement. Ainsi, l’absorbance mesurée est proportionnelle à la quantité de ces résidus, et donc approximativement à la concentration en protéines.
Pourquoi les acides nucléiques absorbent-ils à 260 nm ?
Les bases azotées qui composent l’ADN et l’ARN (purines et pyrimidines) ont des systèmes aromatiques qui absorbent efficacement la lumière à cette longueur d’onde, à travers des transitions π→π∗.
Comment utiliser le rapport A260/A280 pour évaluer la pureté de l’ADN ?
Un rapport A260/A280 proche de 1,8 indique que l’ADN est relativement pur. Des valeurs plus basses peuvent signaler une contamination par des protéines, tandis que des valeurs plus élevées suggèrent la présence d’ARN ou d’autres contaminants.
Qu’exprime la loi de Beer-Lambert en spectroscopie ?
Cette loi mathématique exprime que l’absorbance d’une solution est proportionnelle à la concentration de l’analyte, à la longueur du trajet optique (généralement la largeur de la cuve) et au coefficient d’absorption molaire. Elle est formulée comme A=εcl, et constitue la base des dosages quantitatifs en spectroscopie UV-Vis.
Dans quel contexte applique-t-on la loi de Beer-Lambert ?
Elle est utilisée lorsqu’on souhaite déterminer la concentration d’un analyte en solution à partir d’une mesure d’absorbance. Elle est valable tant que le système suit un comportement linéaire, sans interférence ou effet de concentration.
Qu’est-ce que le coefficient d’absorption molaire (ε) ?
C’est une constante spécifique à une molécule et à une longueur d’onde donnée. Elle reflète la capacité d’un composé à absorber la lumière : plus ε est élevé, plus la molécule est fortement absorbante.
Pourquoi la loi de Beer-Lambert ne s’applique-t-elle pas toujours ?
La linéarité de la loi est limitée par certains facteurs, comme des interactions entre les molécules à forte concentration, des effets de réabsorption, des changements de pH ou encore des erreurs instrumentales (lumière non monochromatique).
Quelles sont les principales limites pratiques de la loi ?
Elle perd en précision à des concentrations élevées (déviations non linéaires), si la lumière utilisée n’est pas parfaitement monochromatique, si la solution contient des substances qui absorbent également ou si des réactions chimiques ont lieu en parallèle.
Pourquoi le choix du solvant est-il critique ?
Un solvant inadéquat peut lui-même absorber la lumière dans la même région que l’analyte ou interagir chimiquement avec lui, faussant la mesure. Il est donc important d’utiliser un solvant transparent à la longueur d’onde choisie.
Comment vérifier si la loi est bien respectée ?
On peut construire une courbe d’étalonnage en traçant l’absorbance en fonction de la concentration pour plusieurs standards. Si la courbe est linéaire (coefficient de corrélation proche de 1), la loi est respectée dans cette gamme.
Pourquoi la propreté des cuves est-elle cruciale ?
Toute impureté, trace de doigts ou dépôt sur les parois d’une cuve peut altérer la transmission de la lumière, provoquer une absorption parasite, et ainsi entraîner des erreurs dans la mesure de l’absorbance.
En quoi l’utilisation d’une lumière monochromatique améliore-t-elle la précision ?
La loi suppose une absorption à une longueur d’onde précise. Une lumière polychromatique conduit à une absorption moyenne, ce qui dégrade la linéarité et introduit de l’incertitude dans la quantification.
Pourquoi l’analyse à λmax est-elle recommandée ?
Le maximum d’absorption correspond à la plus grande sensibilité, donc à une meilleure précision. C’est aussi à cette longueur d’onde que les variations de concentration entraînent les changements les plus nets d’absorbance.
Quels sont les composants essentiels d’un spectrophotomètre UV-Visible ?
L’appareil comprend une source de lumière, un système de sélection de longueur d’onde (monochromateur ou filtre), une cuve contenant l’échantillon, un détecteur pour mesurer la lumière transmise, et un système d’affichage ou d’analyse des données.
Quelle est la différence entre un filtre et un monochromateur ?
Les filtres sont des éléments simples qui bloquent toutes les longueurs d’onde sauf une bande étroite. Les monochromateurs sont plus précis : ils utilisent un prisme ou un réseau pour disperser la lumière et isoler une seule longueur d’onde.
Pourquoi utilise-t-on deux types de lampes dans le spectrophotomètre ?
Les lampes à deutérium émettent efficacement dans l’UV (190–400 nm), tandis que les lampes tungstène-halogène couvrent le domaine visible (400–800 nm). Une lampe unique ne permet pas de couvrir les deux domaines efficacement.
Quel est le rôle d’une cuve dans une analyse spectroscopique ?
La cuve contient la solution à analyser. Elle doit avoir des parois planes, une épaisseur connue (souvent 1 cm), être exempte de rayures ou d’impuretés, et être adaptée au domaine spectral étudié (ex. quartz pour l’UV).
Comment le détecteur mesure-t-il l’absorbance ?
Il mesure l’intensité de la lumière transmise par l’échantillon et la compare à une intensité de référence (souvent le blanc). Il calcule ensuite l’absorbance selon la relation A=log(I0/I).
Pourquoi l’alignement des composants optiques est-il important ?
Un mauvais alignement entraîne une perte de signal, de la lumière parasite ou une mauvaise focalisation, ce qui nuit à la précision, à la sensibilité et à la reproductibilité des mesures.
À quoi sert un blanc en spectrophotométrie ?
Le blanc contient tous les éléments de la solution sauf l’analyte. Il permet de corriger l’absorbance de fond due au solvant ou aux réactifs et d’obtenir une mesure exacte attribuée uniquement à l’analyte.
Pourquoi certaines cuves sont-elles inadaptées pour l’UV ?
Les cuves en plastique ou en verre ordinaire absorbent la lumière dans l’UV. Seules les cuves en quartz sont suffisamment transparentes en dessous de 300 nm pour permettre des mesures fiables.
Comment un spectrophotomètre à double faisceau améliore-t-il les performances ?
Il compense en temps réel les fluctuations de la source lumineuse ou les perturbations optiques en mesurant simultanément l’échantillon et le blanc. Cela permet une correction automatique et une meilleure stabilité du signal.
Pourquoi la calibration régulière d’un spectrophotomètre est-elle essentielle ?
Elle garantit que les mesures sont fiables et reproductibles. La calibration permet de corriger les déviations dues à l’usure des composants, à la dérive des sources lumineuses ou à des erreurs de positionnement des longueurs d’onde.
Qu’est-ce que la fluorescence en spectroscopie ?
La fluorescence est un phénomène d’émission de lumière qui se produit lorsqu’une molécule ayant absorbé un photon à haute énergie retourne à son état fondamental en émettant un photon de plus faible énergie. Cette émission survient généralement quelques nanosecondes après l’absorption et constitue un outil très sensible pour l’analyse.
Pourquoi la fluorescence est-elle plus sensible que l’absorbance ?
En absorbance, on mesure une faible différence entre deux signaux intenses (lumière incidente et transmise), ce qui est limité par le bruit de fond. En fluorescence, on détecte une émission lumineuse spécifique sur fond noir, ce qui permet de détecter des concentrations bien plus faibles, souvent dans l’ordre du nanomolaire.
Quelles sont les étapes fondamentales de la fluorescence ?
- Absorption d’un photon par un électron,
- Passage rapide vers un état vibrationnel inférieur de l’état excité (relaxation non radiative),
- Retour de l’électron vers l’état fondamental avec émission d’un photon, à une énergie inférieure à celle du photon absorbé.
Pourquoi le photon émis a-t-il une énergie plus faible que celui absorbé ?
Après excitation, une partie de l’énergie absorbée est perdue sous forme de chaleur (relaxation vibrationnelle), ce qui fait que le photon émis a une longueur d’onde plus longue et donc une énergie plus faible — c’est le fondement de l’effet Stokes.
Qu’est-ce que l’effet Stokes en fluorescence ?
C’est la différence observée entre la longueur d’onde d’absorption maximale (excitation) et celle d’émission maximale. Ce décalage est toujours positif et permet de différencier nettement le signal de fluorescence du rayonnement d’excitation.
Qu’est-ce que l’émission retardée ou phosphorescence ?
Contrairement à la fluorescence, qui est rapide, la phosphorescence implique un changement d’état de spin (état triplet) et une émission lumineuse lente (de microsecondes à secondes). Elle est moins courante mais présente dans certains composés.
Quels sont les composants d’un spectrofluorimètre ?
L’appareil comprend une source lumineuse (lampe ou laser), un monochromateur pour sélectionner la longueur d’onde d’excitation, une cuve pour l’échantillon, un second monochromateur pour l’émission, un détecteur très sensible (souvent photomultiplicateur), et un système d’analyse des signaux.
Pourquoi la détection se fait-elle à 90° de l’excitation ?
Cette géométrie permet de minimiser la détection directe de la lumière incidente et d’optimiser le rapport signal sur bruit. Elle évite aussi les réflexions parasites et maximise la spécificité du signal fluorescent capté.
Qu’est-ce qu’un spectre d’excitation en fluorescence ?
Il s’agit de l’enregistrement de l’intensité de la fluorescence à une longueur d’onde d’émission fixe, en faisant varier la longueur d’onde d’excitation. Ce spectre reflète l’efficacité d’excitation de la molécule et permet d’identifier le meilleur λ d’excitation.
Qu’est-ce qu’un spectre d’émission ?
C’est un graphique montrant l’intensité de la lumière émise par une molécule après excitation à une longueur d’onde fixe, en fonction de la longueur d’onde d’émission. Il permet de caractériser la molécule et de détecter des interactions avec l’environnement.
Comment la structure chimique influence-t-elle la fluorescence ?
Les structures rigides et aromatiques favorisent les transitions électroniques efficaces et donc la fluorescence. Les molécules flexibles ou avec des groupements carbonyles ont plus de modes de dissipation non radiative, ce qui diminue l’émission lumineuse.
Pourquoi les molécules aromatiques sont-elles de bons fluorophores ?
Leur structure conjuguée permet une délocalisation électronique stable, favorisant les transitions π→π∗. Cette configuration réduit les pertes d’énergie non radiatives et favorise une émission intense et reproductible.
Comment le pH affecte-t-il la fluorescence d’une molécule ?
Le pH peut modifier l’état d’ionisation des groupes fonctionnels de la molécule, influençant la distribution des charges et les niveaux d’énergie électroniques. Cela peut entraîner un changement de l’intensité ou un décalage de la longueur d’onde d’émission.
Quels effets les solvants ont-ils sur la fluorescence ?
Le solvant peut stabiliser différemment les états fondamental et excité. Il peut aussi interagir physiquement ou chimiquement avec la molécule, entraînant un déplacement des bandes d’émission (effet bathochrome ou hypsochrome) ou une extinction partielle du signal.
Qu’est-ce que le quenching en fluorescence ?
Le quenching est l’extinction ou la réduction de la fluorescence causée par des interactions entre le fluorophore et d’autres molécules. Il peut être dynamique (collisions) ou statique (formation de complexes non fluorescents), et affecte la sensibilité des mesures.
Quels sont des exemples de quenchers courants ?
L’oxygène moléculaire, les ions halogénures (Cl⁻, I⁻), les métaux de transition (Cu²⁺, Fe³⁺) ou encore certains composés aromatiques peuvent réduire la fluorescence d’un analyte par transfert d’énergie ou formation de complexes.
Qu’est-ce que le rendement quantique de fluorescence ?
Il représente l’efficacité d’un fluorophore à convertir des photons absorbés en photons émis. Un rendement de 1 signifie que chaque photon absorbé donne lieu à un photon émis, tandis qu’un rendement faible indique des pertes énergétiques importantes.
Quels acides aminés sont naturellement fluorescents ?
Le tryptophane est le plus fluorescent, suivi de la tyrosine, puis de la phénylalanine. Le tryptophane est souvent utilisé pour suivre les changements de conformation ou l’environnement local des protéines en solution.
Comment la fluorescence est-elle utilisée en biologie ?
Elle est utilisée pour localiser et quantifier des protéines, mesurer des interactions moléculaires, suivre des processus en temps réel, ou marquer des structures cellulaires avec des fluorophores comme la GFP ou la rhodamine.
Quels sont les avantages analytiques de la spectrofluorimétrie ?
Elle offre une sensibilité extrêmement élevée, une grande sélectivité, la possibilité de détecter des quantités infimes de substances, et une adaptabilité à de nombreuses matrices. Elle est aussi compatible avec les analyses en temps réel ou en conditions biologiques complexes.
