Cours 10 : génétique moléculaire Flashcards
Une variabilité pathologique du génome (mutation) doit avoir 3 caractéristiques : lesquelles?
Doit être une changement…
- permanent
- transmissible
- entraînant un phénotype patho
L’humain a ___ milliards de nucléotides et _____ millions de variations génétiques en moy, en comparant au génome de référence. Environ _____ mutations surviennent de novo. La plupart des mutations (ont/n’ont pas) d’effet phénotypique (polymorphismes, récessif, rég non codante)
- 3
- 5-6
- 70
- n’ont pas
Voici une liste de variations NON patho : placer en ordre de grandes, moy et petites.
- microsatellites
- SNP
- CNV
- indels
- LINE
Grandes :
- CNV
- LINE
Moy :
- microsatellites
Petites :
- SNP
- indels
Quel est le type de mutation le plus fréq?
Substitutions
Les 4 différentes conséquences des variations de génome, en ordre croissant de sévérité.
1) homologue : change codon, mais même a.a.
2) faux-sens : change codon pour un autre a.a.
3) non-sens : codon stop
4) altération du cadre de lecture (insertion/délétion n’étant pas multiple de 3)
Éléments à considérer concernant à quel pt une mutation est grave (5).
1) fréq pop
2) conservation
3) impact sur ARNm
4) impact sur prot
5) fct du gène
V/F?
La perte ou le gain de fct d’une prot peuvent entraîner un phénotype patho.
V
Mécanismes associés aux gains de fct des prots. (5)
1) augmentation du dosage génique
2) altération de l’expression de l’ARNm
3) activité accrue de la prot
4) nouvelle fct de la prot
5) altérations toxiques à la prot
Les mutations dynamiques…
Elles ont 3 niv et 2 stades de transition (en ordre croissant) : _________, __________, _________, __________, _________. Il y a 2 catégories : une avec les expansions _________, et l’autre, avec les expansions _________. Typiquement, répétition de ____nucléotides.
- normal
- zone grise
- prémutation
- zone de pénétrance réduite
- mutation complète
- ++ grandes
- bcp moins grandes
- tri
Isolation de l’ADN…
Se fait dans des cells ________ (svt les ________). Il faut se servir des ____________ de l’ADN par rapport au reste du ____________. La technique principale utilisée est celle des ___________ (VS ancienne : __________). Ses avantages : __________ et ____________. Avec cette technique, l’ADN est absorbé sur ___________. Les autres substances restent dans _________. On peut évaluer l’efficacité de l’isolation par __________ (_____ nanomètres = absorbance max ADN) ou par ____________.
- nucléées
- leucocytes sanguins
- caractéristiques spécifiques
- contenu cellu
- sels chaotropiques
- phénol-chlorophorme
- non toxique
- automatisable
- colonne de verre/membrane
- l’eau
- densité optique
- 260
- teintures intercalantes
Hybridation :
On construit une séq __________ (se nommant __________) qui est ____________.
- complémentaire
- sonde
- marquée
Buvardage Southern…
Le principe de base est : _____________. On commence par une __________ de l’ADN génomique. Puis, on fait l’____________. On transfert le tout sur une ___________, en présence d’une _________ pour faire l’____________. La détection peut ensuite se faire par _____________. Cette technique permet de ___________________. Selon le nombre de bandes qu’on voit, il y a le même nombre de ___________.
- combinaison d’électrophorèse et hybridation
- digestion
- électrophorèse
- membrane
- sonde
- hybridation
- autoradiographie
- quantifier les grandes expansions (mutations dynamiques)
- gènes
https://www.youtube.com/watch?v=vBATs6Jhk44&t=197s
Composantes de la réaction PCR (6). (ce dont on a besoin pour la réaction)
- ADN du patient
- amorces
- polymérases
- nucléotides
- tampon
- autres additifs si nécessaire
PCR…
La polymérase la plus fiable est la ____. La technique consiste d’un ________ qui se répète et qui augmente la qtt d’ADN de x___ à chaque fois.
- Taq
- cycle
- 2
PCR-migration…
Le principe de base est : _____________. Permet de _____________. Pour la détection du signal, c’est la __________ où se situe la bande p/r au _________ qui reflète sa taille. Pour l’interprétation : si la bande obtenue est derrière la bande initiale, il y a _____________. Pour l’inverse, c’est une ___________. Est utilisée pour les contaminations fœto-maternelles (s’il y a une ________) et les investigations judiciaires.
- électrophorèse capillaire des produits de PCR
- détecter insertions ou délétions
- distance
- puits
- délétion
- duplication/insertion
- 3e bande plus petite entre les 2 grandes
PCR digestion…
Principe : une ___________ digère un ____________. Si la séq est reconnue, il y aura _______. Sinon, pas clivage. Applications : __________. Il est habituellement possible de trouver un site de restriction ______ ou ______ par la mutation que l’on cherche. Pour l’analyse, sur l’ordinateur, si le site est reconnu et devrait l’être, on va avoir un nombre ______ d’ADN ayant un nombre diff de pb. Par contre, s’il y a eu abolition d’un site de restriction par la mutation, on va avoir un nombre ______ d’ADN ayant un nombre diff de pb.
- enzyme de restriction
- prod de PCR
- clivage
- mutations ponctuelles récurrentes
- créé
- aboli
- assez restreint
- plus élevé
ASPE (allele specific primer extension)…
Le tout commence par une __________ (comme bcp de techniques). On marque ensuite des _________ dont certaines ont un ____________. Si on détecte une __________, c’est qu’il y a eu ___________ dans l’ADN.
- amplification PCR
- amorces fluo
- mismatch 3’
- extension
- mismatch
Sanger…
Commence par une ________, puis une ____________ et une ______________ avec mélange de _____________. Les _______ sont utilisés pour le marquage, car ils __________ la liaison du prochain dNTP (se nomme la ____________). L’incorporation de ddNTP est (précise/aléatoire). Ses applications : __________ _______________, ____________. Ne détecte pas les ____________.
- PCR
- dénaturation
- réamplification
- nucléotides modifiés marqués par fluo
- ddNTP
- empêchent
- chain termination
- aléatoire
- substitutions
- gènes avec GRAND NOMBRE de mutations dispersées
- petites insertions/délétions
- grandes anomalies
https://www.youtube.com/watch?v=FvHRio1yyhQ
PCR temps-réel…
Principe : _______________. Elle peut se faire par _________ ou par _____________. La sonde _________ est composée d’un ___________ et d’un _____________. Quand la sonde se lie à l’ADN, le ____________ se libère et génère une fluo. Pour la discrimination allélique, on utilise la _________ des _________ pour distinguer les allèles. Pour la quantitative, on utilise le ___________ pour trouver les mutations.
- réaction PCR avec détection du produit simultanément
- discrimination allélique
- quantification
- Taqman
- rapporteur
- “quencher”
- rapporteur
- couleur
- allèles diff
- seuil arbitraire
https://www.youtube.com/watch?v=iu4s3Hbc_bw
MLPA (multiplex ligation probe amplification)…
Méthode pour la recherche de ____________. Il y a une sonde ayant _________ qui doivent ____________ sur _________. La ___________ scelle ensuite les 2 sous-unités. Il y a ensuite ______________ et _____________ Selon la ________ détectée, on peut voir si il y a eu une duplication/délétion normale ou anormale.
- duplications/délétions
- 2 sous-unités
- s’hybrider côte-à-côte
- ADN
- polymérase
- amplification PCR
- électrophorèse
- qtt
Le séquençage de nouvelle génération…
Permet de ____________ d’une analyse. Possibilité d’analyser plsrs __________ et plsrs __________ en même temps, grâce à un ____________. Premièrement, on utilise la sonication pour __________ l’ADN. Ensuite, on veut faire une étape de __________ pour isoler les _______ du _________ précis qu’on veut. On va donc prendre des “cribles de capture”. Après, on va lier le code-barre (adapteur). Suite à cela, on peut faire l’___________ en parallèle. Elle se fait par PCR-_________ (pas par PCR émulsion comme avant). Cette PCR se fait à chaque mol, dans un petit _________. Il y a une chain termination, comme dans Sanger, mais celle-ci est __________. Une fois cette étape faite, on a généré plsrs milliers de séqs d’environ ________ pb qui peuvent être attribuées à chaque patient. Il faut finalement procéder à l’____________ des séqs au bon endroit du ____________, puis identifier les ______________ qui pourraient être présentes, et voir si elles sont ___________ (pourraient expliquer le phénotype).
- multiplier l’info obtenue
- gènes
- patients
- code-barre moléculaire
- fragmenter
- capture
- exons
- gène
- amplification
- cluster
- compartiment
- réversible
- 100-150
- alignement
- génome
- variations
- pathologiques
