chap 5 part 2 - transcription (eucaryotes) Flashcards
1
Q
génome orga multicelR possède (8)
A
- bcp espace entre gènes + tous gènes sont monocistoniques = 1 promoteur par gène + 1 gène par ARNm
- exon = expression génique -> prot (structure I) -> folded protein (structure III)
- ARNm jusque traduction -> tous autre types ARN transcription seulement
- séQ régulatrices ADN -> promoteurs + placement facteurs transcription généraux et spQ par autres sites -> contrôle transcription du gène
- expression génique -> réponse au programme du devt + changements internes-externes : “1 tel gène ds une telle cell et à 1 tel moment”
- plupart séQ régulatrices au début des gènes mais peuvent être aussi présentes + loin
- tous gènes transcrits mais traduction ceux codant des prot (ARNm)
- Cf diapo 2
2
Q
transcription par 3 ARN polymérases (transcriptases) (7)
A
- ARNpol-I -> ds nucléole, transcription ARNr
- ARNpol-II -> ds nucléoplasme, transcription ARNm
- ARNpol-III -> ds nucléoplasme, transcription ARNt
- ARNpol-I et III -> transcrits très abondants pr besoins de transcription -> besoin régulation ‘fine’ -> besoin tt le temps et en grande QT = tt le temps bcp régulation, prod° constante
- transcriptase-II -> prod° ~20 000 transcrits ARNm différents/cell / variation abondance relative transcrits de qques copies à >10 000
- efficacité = cb transcrits par unité de temps
- pol-II -> reconnaissance milliers promoteurs nécessaires + variation efficacité transcription => force promoteur + facteur transcription
3
Q
4 similarités entre transcriptase-II et transcriptase procaryote (9)
A
- site catalytique
- mêmes 5 passages
- forme pince de crabe
- activité hélicase car même bulle transcription
- compo de 12 sous unités (protomères) : RPB1-2-3-…12 / RBP1 contient domaine-C-terminal (CTD) = impte
- CTD = C-terminal-domaine (chaine d’AA) -> phopshorylé aux positions spQ + fait recrutement
- CTD aussi utilisé chez queues-N des histones
- Cf diapo 4
4
Q
CTD (9)
A
- répétitions en tandem de heptapeptide Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser
- 26 copies heptapeptide chez levure VS 52 chez mammifères -> recrutement avec + prot ≠ chez mammifères
- recrutement facteurs initiation / élongation / terminaison
- recrutement facteurs de maturation des pré-ARNm (couplage transcription-maturation durant élongation
- CTD non phosphorylé
- CTD phosphorylé -> lecture code : 6/7 répétitions phosphorylées = 1er heptapeptide +P sur Ser en position 2 -> Ser2-P // heptapeptides 2 à 6 -> +P sur Ser en position 5 (Ser5-P)
- logique de quel AA sur quelle répétition sera phosphorylé
- ++ on avance, + phosphorylation change
- Cf diapo 5
5
Q
changements sur le CTD durant transcription : exemple de terminaison chez levure (12)
A
- Cf diapo 6
- 26 répétitions deTyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser
- Pcf11 -> maturation ARNm (coupure et polyA)
- Rtt103 -> terminaison transcription -> détachement transcriptase
- courbe représente QT prot attachées sur CTD
- Tyr1P -> bloque arrivée Pcf11 et Rtt103 / retrait progressif des P sur Tyr1
- Ser2P -> recrutement Pcf11 et Rtt103
- Thr4P -> recrutement Rtt103
- pas P au début, retrait P à fin
- Rtt103 peut se lier sur Ser4P + Thr4P
- PAS = site poly A (fin gène)
- après PAS -> plus séQ codantes, transcription dépasse tjs fin gène
6
Q
+P différents sur CTD nécessaires pour chQ phase transcription (11)
A
- Cf diapo 7
- qd courbe monte -> + heptapeptides avec modification spécifiée
- courbes -> QT phosphorylation
-Thr4P recrute facteurs terminaison - Ser2P recrute enz maturation
- complexes remodelants + modificateurs des queues-N des histones -> action sur chrtine, modif nocléosome -> changement place ou les enlève
- nécessité ADN nu au niveau du promoteur
- queue CTD + phosphorylée pdt élongation
- 1) ouverture = isomérisation ADN / ADN positionné = complexe fermé VS isomérisation = compexe ouvert
- 2) recrutement facteurs élongation particuliers nécessaires (CTD doit être phosphorylé correctement) -> aide échappement promoteurs
- 3) complexe ternaire stable
- 4) terminaison -> empêche que enz reste sur ADN
7
Q
promoteurs de transcriptase-II : 4 séQ conservées (9)
A
- Cf diapo 8
- TFII = facteur transcription pour ARNpol-II
- facteurs transcription généraux liant promoteur ~ rôle de σ bactérienne
- séQ consensus -> BRE, TATA, Inr, DPE
- BRE = TFIIB recognition element
- TATA = endroit flexible pour formation complexe de pré-initiation qd présent / permet plier ARN pr installation facteurs généraux dessus
- Inr = initiator / élément + fréquent -> doit être facile à ouvrir
- DPE = downstream promoter element -> région transcrite en +, pas forcément séQ codante, peut être ds intron
- promoteur typiquement constitué de 2-3 de ces 4 éléments -> promoteur basal
8
Q
facteurs transcriptions généraux (GTF) (6)
A
- permettent asso transcriptase au promoteur + initiation transcrption (isomérisation + échappement au promoteur)
- autres facteurs transcription -> facteurs généraux + spQ + GTF
- plupart GTF = complexes protQ multimériques (pl. sous unités ou protomères) -> TFIIA, TFIIB etc
- TFIID = le + grand et 1er à agir pr formation complexe initiation -> compo de TBP (TATA binding protein) + 13 TAF (TBP associated factor)
- TBP -> interaction TBP-TATA la + forte (TBP suffisant pr initier transcription in vitro)
- TAF -> reconnaissance Inr ou DPE / possibilité régulation asso TBP-TATA en cachant site sur TBP
9
Q
assemblage complexe initiation. de transcription (8)
A
- Cf diapo 10
- 1) asso TBP-TATA -> plateforme nécessaire pr recrutement autres GTF
- 2-3-4-5) série de recrutement
- interaction directe pr commencer à plier ds sillon mineur -> pas besoin aller chercher pb + plus facile à plier
- TBP parcourt ADN -> qd rencontre avc TATA -> pliage région / pas reconnaissance pb
- TFIIB lie TBP et BRE
- insertion TFIIB-N ds transcriptase (ds sortie ARN) => complexe fermé
- TFIIH -> hydrolyse ATP, hélicase, phosphorylation CTD => complexe ouvert / besoin TFIIH pr ouverture bulle transcription
10
Q
complexe ouvert -> complexe initial -> complexe ternaire (élongation (8)
A
- Cf diapo 11
- étape initiation limitante
- complexe ouvert -> TFIIH (hélicase)
- entre complexe initial et ternaire -> TFIIH (+P sur CTD de transcriptase)
- TFIIH -> recrutement facteurs élongation + échappement au promoteur
- phosphorylation CTD par autres prot pdt élongation
- élongation -> départ tous GFT sauf TBP car ça va recommencer
- aussi longtemps que besoin du gène, sillon reste plié tant que TBP est là
11
Q
complexe médiateur permet accès à ADN ‘nu’ (5)
A
- pour transcriptase + facteurs transcription (généraux et spQ)
- complexe médiateur > 20 sous unités
- complexes remodeleurs de chrtine + modificateurs d’histones
- asso avec transcriptase + ≠ facteurs de transcription
- élimination sous unité particulière -> affecte expression d’1 sous (e) de gènes (selon activateur/inhibiteur avec lequel faisait interaction)
12
Q
déroulement typique euchrtine (6)
A
- Cf diapo 13
- modificateurs histones -> faire partie médiateur ou agir en avance pour faire place
- 1) médiateur -> fait place en bougeant nucléosomes
- 2) assez place pour transcriptase et GEF
- 3) blocage par nucléosomes suivants -> rare que ADN proca vide sur longues régions
- 3 bis) élongation si voie libre = si pas autre nucléosome
13
Q
pdt étape élongation transcription eucaryote (7)
A
- phosphorylation CTD -> recrutement facteurs élongation + maturation ARNm
- ++ P sur AA particuliers pr chQ facteur différent
- facteurs élongation -> stimulation transcriptase, aide avec correction
- maturation ARNm : 1) enz addition de coiffe / 2) compos machinerie épissage (coller exon 1 et 2) / 3) facteurs polyadénylation + clivage
- modif° nucléosomes par FACT (facilitates chromatin transcription) -> enlèvement 1 dimère H2A-H2B du nucléosome devant transcriptase -> espace suffisant pr transcription ADN enroulé par enz
- dimère gardé par FACT
- dimère remplacé après passage transcriptase
14
Q
étape terminaison de transcription eucaryote (7)
A
- Cf diapo 15
- synthèse ARN par transcriptase-II jusqu’au dépacement séQ de clivage-polyadénylation (poly-A signal = PAS)
- 1) attachement complexe du clivage-polyadénylation en avance au CTD-P
- 2) transfert sur le PAS transcrit (ARN)
- 3) coupure ARNm + ajout 200 adénines sur bout 3’
- 4) transcriptase continue transcription même si majT ARN enlevé
- terminaison de transcription nimporte où sur région de 0,5-2 kb dépassé le PAS -> dégradation rapide 2nd ARN produit
15
Q
après clivage ARNm : modèle torpedo de terminaison (5)
A
- Cf diapo 16
- prot Rtt103 -> liaison CTD et recrutement exonéucléase Rat1
- liaison Rat1 au bout restant du transcrit tjs attaché à polymérase + dégradation
- qd Rat1 rattrape transcriptase -> la frappe et transcriptase part
- prot avec mécanisme similaire -> TRCF (fait avancer transcriptase) + Rho (terminaison transcriptase proca)
16
Q
résumé étapes-évènements clés initiation (5)
A
- 1) médiateur déroule promoteur
- 2) arrivée facteurs transcriptions généraux : arrivée TFIID en 1er -> contient TBP qui plie ADN sur TATA, puis arrivée autres
- 3) ADN plié -> recrutement transcriptase sur TFIIB -> complexe fermé
- 4) ouverture ADN = isomérisation avec TFIIH -> complexe ouvert
- 5) échappement au promoteur avec TFIIH qui ajoute P sur CTD -> recrutement facteurs élongation qui permettent échappement au promoteur
17
Q
résumé étapes-évènements clés élongation (4)
A
- changement continu de phopshorylation sur CTD
- recrutement facteurs élongation + maturation
- besoin FACT pr passage à travers nucléosomes
- polymérisation ARN jusqu’au signal de clivage PAS et après terminaison
18
Q
résumé étape-évènement clé terminaison
A
modèle torpedo (torpille), exonucléase nécessaire (attachement enz qui mange ARN qui reste)
19
Q
base clonage traditionnel (11)
A
- construction ARN recombinant + maintien ds cells -> enz restriction -> prod° fragments ADN -> ligase soude fragments ds plasmides (vecteurs = qui peut transmettre qqch) -> insertion dans bact (plasmides ont origine bactérienne)
- ADN recombinant -> bricolage petite partie ADN, ajout ADN non présent de base
- maintien dans cells -> cells + ce qu’on rajoute se répliquent
- enz restrictions -> coupe séQ précise, prod° fragments ADN
- ligase -> liens phosphodiesters entre brins
- modif plasmide naturel -> plasmide vecteur
- ORI forte impte pr vecteurs propagation (amplification)
- promoteurs impts pr vecteurs expression (prod° prot) car dicte cb prot reçues au final
- ORI -> réplication
- marqueur sélection -> marquage colonies qui ont reçues vecteurs
- site de multiclonage (MCS) -> couper + insertion fragment désiré
20
Q
plasmide naturel (5)
A
- forme circulaire
- chez proca (bcp chez bact, peu chez arkea)
- répliaction indépendante du génome
- contient PAS plasmides ds milieu optimal
- plasmides en conditions particulières -> contient gènes bonus et PAS essentiels ds certaines conditions envtales
21
Q
influence nb copies produites du vecteur par cell par ORI (9)
A
- Cf diapo 20
- certains vecteurs limités à qques copies -> faible rendement
- vecteurs -> 500-1000 copies/bact -> haut rendement
- facteurs impts pr rendement ORI -> facilité ouverture + reconnaissance
- vecteur de propagation pr amplification ADN -> haut rendement réplication nécessaire
- vecteur propagation -> alternative PCR
22
Q
vecteurs expression (7)
A
- Cf diapo 20
- ont 1 promoteur actif -> rep à régulation génique / promoteur dérivé génome de orga hôte car promoteur doit être adapté à orga
- impce choix promoteur -> force + régulation + provenance
- promoteur constitutif -> non régulé
- mutant de surexpression -> promoteur arrête pas, tjs actif
- changement promoteur selon orga qui reçoit
- marqueurs fluorescents / détectables par Ac -> possibilité ajout pour suivre prod° prot
23
Q
description promoteur : prod° insuline humaine dans E.coli (5)
A
- promoteur doit venir de E.coli
- promoteur reconnu par σ70
- promoteur fort -> séQ consensus pour -35 et -10
- ajout bonus -> élément constitutif + élément A
- promoteur constitutif -> pas activateur spQ nécessaire
24
Q
site de multiclonage (“polylinker”) (6)
A
- contient pl. sites restriction -> insertion fragments ADN
- coupure fragment ADN qu’on veut insérer + vecteur par même enz restriction ou enz différentes -> génération coupures cohésives compatibles
- insertion pas réussies à 100% -> fermeture pl. vecteurs et fragments sur eux mêmes
- 1) coupure enzQ sur plasmide
- 2) 3 possibilités : plasmide non recombiné = se referme sur lui même // coupure enzQ sur ADN -> ADN non recombinant = se referme sur lui même // plasmide + ADN non recombinés => plasmide recombiné
- 3) transformation
25
Q
introduction de ADN recombinant (8)
A
- ADN recombinant = plasmide + gène introduit
- introduction ADN recombinant ds cell hôte par transformation
- transformation = process de récupération ADN présent dans mx extracelR des orgas
- certaines bact -> compètence naturelle = compétence génétique
- plupart bact ont pas compétence génique -> nécessité les rendre compétentes -> choc thermique et électroporation
- bact rendues compétentes -> incorporation +/- 1 vecteur (taux transformation très bas) -> cells mortes car sortie cytoplasme par trous -> peu survivants et encore - avec chaleur
- action chaleur pr rendre bact compétentes -> aug° fluidité phospholipides avec chaleur / hot T° mvmt composants de mbrane, destabilisation structure mbrane
- action choc thermique pr rendre bact compétentes -> choc électrique polarise charges + / ds bact -> alignement charges de chQ coté / mbrane devient instable -> parties trouées -> entrée plasmide
26
Q
marqueurs de sélection : gènes de résistance à 1 antibio (5)
A
- Cf diapo 23
- transformation d’1 bact (ajout ADN ext) pas efficace 100%
- croissance bact sur mx sélectif -> survie bact ayant incorporé vecteur (ont gènes résistance)
- choix milieu sélectif en fonction du vecteur utilisé
- croissance bact après transformation : sans antibio -> croissance transformées + NON transformées / avec antibio -> croissance transformées seulement (vecteur peut être sans insert)
27
Q
2 sélections nécessaires pour trouver clones réussis (6)
A
- 1ère sélection : adaptation milieu sélection au gène présent sur vecteur
- mort bact sans vecteurs (échec transformation)
- 2e sélection : site multiclonage à int du gène lacZ (enz) / si insertion -> gènes plus transcrit
- gène interrompu si insertion réussie / si insertion échouée -> transcription gène se poursuit
- ajout substrat de enz au milieu (+ x-gal) -> possibilité voir si gène exprimé ou non (x-gal hydrolysé par enz lacZ = couleur bleue)
- remplacement 2e sélection dans cas vecteurs expression -> Ac ou fluorescence
