chap 3 - réplication de l'ADN Flashcards
1
Q
idée générale : ‘vieux’ ADN et ouverture double hélice (6)
A
- ‘vieux’ ADN -> fonction matrice
- ouverture +/- facile selon %CG VS %AT -> + simple avc A:T -> lien H doit être brisé
- ORI (origine réplication) riches en AT + reconnues par prot initiatrice
- procaryote -> 1 oeil avc 2 fourches de réplication
- eucaryote -> pl. yeux réplication -> impte longueur chr -> si 1 seul oeil de réplication = réplication longue +++
- enz ds fourche de réplication
2
Q
prot initiatrice de ouverture de double hélice (5)
A
- seule prot -> reconnaissance 1 séQ spQ de bases pour liaison à ADN
- fonction reconnaissance de bonne place d’installation -> complémentarité groupements fonctionnels des AA / liens H en ligne droite ds sillon majeur
- fonction recrutement des autres prot -> forme + alignement groupements fonctionnels
- hélicase de chQ coté des prot initiatrices
- fonction hélicase -> défaire double hélice -> travail avec liens H pr faire ouverture
3
Q
prot initiatrice procaryote (7)
A
- prot initiatrice procaryote = DnaA
- interaction séQ spQ (ADN-prot) -> DnaA.ATP
- interation NON séQ spQ (ADN-prot) -> hélicase
- interaction prot-prot -> entre hélicase (DnaB) et poseur hélicase (DnaC)
- séQ 13-mère riche en AT car c’est celle qui s’ouvre
- rôle ATP -> catalyse réaction pr permettre ouverture
- ADN simple brin -> PAS de sillons -> peut pas être séQ spQ
4
Q
initiateur eucaryote (7)
A
- initiateur eucaryote = ORC (complexe reconnaissance de l’ORI = pl. prot)
- positionnement de ORC coordonné avc cycle celR
- phase G1 -> recrutement par ORC = complexe pré-réplicatif
- phase S -> activation réplication = induit phosphorylation prot (départ ORC, arrivée polymérases)
- S = complexe réplicatif = réplisomes
- cells souches + qques cells différenciées exceptionelles font G1 -> S
- reconnaissance séQ OU motif structurel de ADN selon espèce (aug° AT, aug° CG, nucléosomes, etc)
5
Q
fonctionnement de hélicase selon modèle escalier rotatif (3)
A
- attachement des boucles d’ADN sur groupements phosphate
- 1 morceau à la fois
- nécessaire de garder 2 brins d’ADN séparés
5
Q
ouverture double hélice : hélicase (7)
A
- hélicase = enz hexamétrique en forme anneau -> entoure ADN simple brin + déplacement rapide le long de chaine en hydrolysant ATP (1000nt/sec)
- ATP brise liens H
- procassivité pr 1 enz = efficacité -> nb de paires de base qu’elle peut séparer avant d’être inactive
- forme hélicase -> haute processivité
- passage ADN par trou de hélicase -> exclusion stérique nécessaire -> forme pas compatible -> entrée simple brin uniquement
- domaine pr assemblage -> “épingles”
- pl. domaines = 1 pr recrutement + 1 pr assemblage + 1 pr passage ADN ds trou de hélicase
6
Q
ouverture double hélice : SSB (8)
A
- SSB = Single Stand Binding proteins
- empêchement que brins séparés se retrouvent
- pas d’épingles dans brins car si épingles présentes -> détachement transférase
- empêchement retour au double brin + blocage formation épingles
- auto-complémentaires -> consolidation
- protection contre épingles + garde ADN en ligne droite et stable
- liaison avec charpente de l’ADN
- utilisation arginine et lysine -> enroulement ADN -> le garder séparé
7
Q
ouverture double hélice : topoisomérases (ADN gyrases) (7)
A
- enlèvement tensions (supercoils) = superenroulement causé par travail de hélicase (penser à des écouteurs à fil emmêlés)
- Cf schéma diapo 9 chap 3
- 1) installation sur ADN -> reconnaissance et installation sur un croisement
- 2) ajout 2 ATP + prise en charge du brin à faire passer
- 3) changement de forme = coupure 2 liens phosphodiesters
- 4) hydrolyse d’1 ATP + passage à travers coupure
- 5) hydrolyse d’1 ATP + soudure
8
Q
synthèse d’1 nveau brin : topoisomérases (2)
A
- topoisomérases à coté de hélicase qd séparation 2 brins
- permet formation fourchettes de réplication
9
Q
synthèse d’1 nveau brin : ADNpol (4)
A
- ADNpol -> nécessité amorce
- ARN primase fabrique amorce en ARN
- double brin = stabilité
- 3’-OH bien positionné dans cycle catalytique
10
Q
synthèse nveau brin : primase et ADNpol-III (6)
A
- enz -> commence réplication de ADN avc amorce en ARN
- amorce complémentaire au brin d’ADN
- enz synthétise nveau brin d’ADN à partir de amorce
- LECTURE du brin matrice d’ADN : 3’ vers 5’
- SYNTHÈSE amorce/nveau brin d’ADN : 5’ vers 3’
- 2 enz -> catalysation formation liaison covalente phosphodiesters
11
Q
synthèse nveau brin : primase (10)
A
- recrutée par hélicase
- domaines complémentaires à primase
- structure hélicase -> 3 domaines ressortent = recrutement 3 primases
- hélicase sur brin qui a besoin de + d’amorces = brin discontinu
- étapes synthèse nveau brin -> diapo 13 chap 3
- étapes 4-5 -> qd primase travaille -> éloignement brin matrice par droite + se décolle
- étape 6 -> SSB lie ADN monocatétaire ‘décollé’ + remet ADN en ligne droite sur prochaine primase et pr faire prochaine amorce
- primases -> faible récessivité
- attraction groupements phosphate par crête basique (+) liée au site actif
- détachement de ADN des primases
12
Q
synthèse nveau brin : amorce (3)
A
- reconnaissance amorce par poseur d’anneaux (clamp-loader) -> il y met un anneau (~chaise) et attachement ADNpol par dessus
- ATP -> ouverture anneau
- étape limitante de réplication = attachement pol sur ADN + pr accélération processus il faut la retenir
13
Q
synthèse nveau brin : attachement du ‘bon’ nucléotide à matrice (5) CF DIAPO 15
A
- ADNpol -> catalysation lien phosphodiester et attachement ‘bon’ nucléotide à matrice
- exposition de 1 nucléotide à la fois
- utilistion ions Mg2+ et Zn2+ par site catalytique -> Cf diapo 15 cours
- dNTP VS NTP : exclusion stérique -> qd O aligné avec O -> ADN trop gros et passe pas // qd O aligné avec P -> lien OK et ADN passe (cf diapo 15)
- compatibilité : sélectivité cinétique -> qd OH trop loin de P -> pas lien H -> pas appariement entre BA // qd OH bien positionné -> lien H -> appariement entre BA (cf diapo 15)
14
Q
synthèse nveau brin : fourche de réplication (10)
A
- fourche de réplication = brin continu + brin discontinu
- 1 oeil réplication = 2 fourches
- synthèse continue du brin directeur de 5’ vers 3’
- synthèse brin discontinu à l’aide fragments d’okazaki de 5’ vers 3’
- 2 brins par fourche = 2 ADNpol
- 1 ADNpol ds même sens direction que ouverture de ADN -> synthèse brin continu
- 1ADNpol ds direction contraire de ouverture ADN -> synthèse brin discontinu
- brin continu = 1 amorce VS brin discontinu = autant d’amorces que de fragments d’okazaki
- modèle procaryote -> hélicase roule sur brin discontinu car besoin uniquement 1 amorce
- fragments okazaki : procaryotes = 1000-2000 nucléotides VS eucaryotes = 100-200 nucléotides
15
Q
synthèse nveau brin : réplisome (complexe de réplication) (5)
A
- coordination brins continu et discontinu
- anneaux -> garder hélicase sur brins
- poseur d’anneaux -> pas perte ADNpol du brin discontinu + l’amène à amorce suivante
- qd rencontre ADNpol et double brin du fragment okazaki précédent -> détachement de anneau
- anneau accueille enz de maturation (retrait amorces et soudure)
16
Q
synthèse nveau brin : réplisome eucaryote (5)
A
- a + de prot que réplisome procaryote + orga différente
- chrtine eucaryote (structure différente de chrtine procaryote) -> eucaryotes ont histones + nucléosomes = + prot nécessaires
- 2 polymérases distinctes : Pol α + Pol δ + Pol ε
- maintien du réplisome par 1 complexe protéique distinct du poseur d’anneaux
- poseur anneaux éjecté du complexe après mise de son anneau -> remplacé par 1 prot
17
Q
synthèse nveau brin chez eucaryotes (6)
A
- ré-assemblement vieux nucléosomes que réplication produit nvx brins
- conservation ‘vieux’ brins -> maintien identité cell -> modif infos ds queues-N des histones dit quelle partie va ds euchrtine +/- active / hétérochrtine // lien diff° celR
- passage réplisome -> désassemblage vieux nucléosomes nécessaire
- 1 partie nucléosome gardée attachée sur réplisome pdt réplication puis remise sur même place ensuite -> qd tétramères positionnés -> départ dimères / infos imptes pr IDT celR sur tétramères
- héritage distributif -> partage des 2 vieux brins en 2 nveaux brins
- recrutement “nvx” entre vieux par anneau (indique nvel ADN)
18
Q
synthèse nveau brin : maturation nveaux brins (6)
A
- ADNpol (ou autre) -> remplacement amorce par ADN
- ADNpol enlève RIBOnucléotides de amorce -> placement DESOXYribonucléotides
- ligase -> liaison phosphodiester entre 2 okazaki
- ADN ligase -> relie fragments okazaki entre eux -> formation dernière liaison phosphosdiester
- enz recrutées par anneau
- amorce de fin brin par remplacée car 3’ nécessaire pr combler brèche mais on est à la fin du chr
19
Q
synthèse nveau brin : procaryotes VS eucaryotes (2)
A
- procaryotes -> séparation chr circulaires
- eucaryotes -> convergence fourche réplication -> formation caténanes qui doivent être résolues
20
Q
synthèse nveau brin : télomérases (6)
A
- amorces en 5’ non remplaçables -> solution = allongement chr par télomérases
- utilisation matrice d’ARN -> allongement extrémité 3’ -> télomères (séQ répétitives)
- bout 3’ dépasse -> protégé par complexe shelterin -> 1 boucle pr le cacher (protection de ce qu’il y a à int de boucle)
- complexe shelterin -> fait diff avc 1 brin d’ADN + évite réparation
- télomérases actives ds cells souches -> activité programmée et + multiplication cells souches = - télomérases actives
- raccourcissement progressif chr à chQ génération celR (vieillissement celR)
21
Q
PCR et séquençage : amplification en chaîne polymérase (PCR) (2)
A
- permet réplication 1 séQ ADN + faire 1 Qt suffisante pr travail biologistes
- pr faire réplication, besoin de :
1) ouvrir ADN -> chaleur !!
2) nucléotides-3-P (en labo)
3) ADNpol (résistant à chaleur)
4) amorces (en labo)
22
Q
PCR et séquençage : Taq polymérase (7)
A
- Taq polymérase provient de bact Thermus -> envt : 93° et +
- technique PCR : répétition même cycle thermique autant de fois que désiré
- 2 min à ~90° -> ouverture ADN qu’on souhaite polymériser
- 2 min à ~60° -> hybridation amorces (attachement)
- 2 min à ~75° -> détachement amorces collées aux mauvaises places
- amorces -> def° séQ ADN à amplifier
- principe PCR et séquençage diapo 29
23
Q
PCR et séquençage : 1ère méthode séquençage (Sanger et al, 1977) (6)
A
- det° séQ exacte des nucléotides
- 1) amplification séQ (PCR)
- 2) prod° amorce connue et radiomarquée en grde Qt
- 3) brin matrice + amorce + ADNpol + dNTP => process réplication
- 4) arrêt réplication avec ajout ddNTP (sans 3’-OH)
- ddNTP provoque arrêt réplication car pas de 3’ = pas réplication possible
(ddNTP = désoxy-désoxynucléotides triphosphate)
24
QUESTION TYPE EXAM : DIAPO 31 CHAP 3
question sur dénaturation et électrophorèse sur gel
