Biotecnologia - Tecnologia do DNA Recombinante

Question 1

O que são as endonucleases de
restrição ou enzimas de restrição?

Answer 1

São tesouras moleculares, isto é, reconhecem e cortam os palíndromos de DNA exógeno (bactérias, por exemplo)

Question 2

Em que consiste a tecnologia do DNA Recombinante?

Answer 2

Conjunto de técnicas que permitem a manipulação de
moléculas de DNA, considerando sequências específicas,
com a perpetuação de tal sequência in vivo.

Question 3

Conceitue clonagem molecular.

Answer 3

Consiste no isolamento e propagação de moléculas de
DNA idênticas -> Clonagem de moléculas

Question 4

Quais ferramentas são utilizadas na clonagem?

Answer 4

Enzimas de restrição, vetores de clonagem, célula hospedeira, DNA ligase e seleção

Question 5

Qual o nome técnico que se dá ao gene de interesse?

Answer 5

Inserto

Question 6

Por quais motivos a bactéria E. Coli é utilizada como célula hospedeira em técnicas de clonagem?

Answer 6

Unicelular;
Cresce rapidamente a 37° (ciclo de 20min);
Pouco exigente quanto a alimentação.

Question 7

Em que consiste o processo de transformação?

Answer 7

Inserir o DNA recombinante na bactéria hospedeira

Question 8

Com qual objetivo se introduz DNA recombinante em bactérias?

Answer 8

As bactérias com o plasmídeo correto são utilizadas para produzirem mais DNA do plasmídeo ou, em alguns casos, induzidas a expressar o gene e produzir proteína.

Question 9

Onde o gene alvo é geralmente inserido?

Answer 9

É inserido num pedaço circular de DNA chamado do plasmídeo.

Question 10

Qual o nome do processo em que o plasmídeo é introduzido em bactérias?

Answer 10

Transformação

Question 11

Como funciona o processo de clonagem do DNA?

Answer 11

1- Cortar e abrir o plasmídeo por meio de enzimas de restrição e “inserir” o gene com o auxílio da DNA ligase..
2- Inserir o plasmídeo na bactéria(transformação). Utilizar a seleção por antibiótico para identificar as bactérias que pegaram o plasmídeo.
3- Cultivar lotes de bactérias portadoras de plasmídeo e usá-las como “fábricas” para fazer a proteína. Colher a proteína das bactérias e purificá-la.

Question 12

Como podemos evitar plasmídeos “ruins”?

Answer 12

Quando nós transformamos bactérias com DNA de uma ligação, cada uma pega um pedaço diferente do DNA. Nós podemos checar as bactérias após a transformação e usar somente as que possuem o plasmídeo correto. Em muitos casos, o plasmídeo de bactérias modificadas é analisado utilizando outra digestão por restrição para ver se ele contém a inserção certa na orientação certa.

Question 13

Por que importa se um gene entra em um plasmídeo ao contrário?

Answer 13

Em alguns casos, não importa. Entretanto, se queremos expressar o gene em bactérias para produzir uma proteína, o gene deve apontar na direção correta em relação ao promotor, ou na sequência de controle que conduz a expressão do gene. Se o gene estiver ao contrário, a fita errada de DNA seria transcrita e não seria produzida proteína .

Question 14

Quais técnicas são comumente usadas para analisar DNA plasmidial de colônias bacterianas?

Answer 14

Classificações de restrição, PCR, e sequenciamento de DNA

Question 15

Por que o DNA bacteriano também não é clivado?

Answer 15

Cada enzima reconhece um ou mais sequências alvo e corta o DNA nestas sequências ou perto delas.

Question 16

Quais as duas classes de enzimas que colocam-se para
gerar e propagar o DNA recombinante?

Answer 16

Endonucleases de restrição
DNA ligases.

Question 17

Quais os três tipos de enzimas de restrição e suas principais características?

Answer 17

Tipo I: Reconhece específicas sequências de DNA porém cortam em locais que podem estar a 1000 pb de distância do sítio de reconhecimento da
enzima;
Tipo II: Reconhece e corta diretamente dentro do sítio
de reconhecimento;
Tipo III: Corte a 24-26 pb a jusante (depois) da sequência de reconhecimento que é assimétrica e de 5 a 7 pb;

Question 18

Quais os tipos de clivagem?

Answer 18

Abruptas e coesivas

Question 19

Diferencie os dois tipos de clivagem?

Answer 19

Extremidades abruptas: os dois cortes ocorrem no eixo de simetria da sequência específica.
Extremidades coesivas: os cortes são feitos simetricamente, porém, fora do eixo de simetria.

Question 20

Qual a função da DNA ligase?

Answer 20

Une o fragmento de interesse ao vetor utilizado, formando um híbrido vetor/fragmento

Question 21

Quais as etapas da clonagem molecular?

Answer 21

1- Preparação do inserto e do vetor;
2- Ligação inserto e do vetor;
3- Transformação em célula hospedeira;
4- Seleção de clones

Question 22

Explique a transformação química.

Answer 22

As bactérias e o vetor são misturados com uma solução de cloreto de cálcio seguido de um choque térmico de curta
duração.
Os íons cálcio têm a função de
neutralizar as cargas do DNA e da
membrana bacteriana, facilitando a passagem do vetor pela membrana no momento do choque térmico.

Question 23

Como ocorre a seleção de bactérias?

Answer 23

Os plasmídeos usados na clonagem contém um gene para resistência a antibiótico. Desta forma, todas as bactérias são colocadas em uma lâmina de antibiótico para selecionar aquelas que incorporaram um plasmídeo. Para isso, podem ser utilizados marcadores. Bactérias sem um plasmídeo morrem. Cada bactéria com um plasmídeo dá origem a um aglomerado de bactérias idênticas, contendo plasmídeo, que são denominadas de colônia. Várias colônias são verificadas para identificar uma com o plasmídeo correto (por exemplo, por PCR ou digestões de restrição).
Uma colônia contendo o plasmídeo correto cresce em volume e é usada para a produção de plasmídeo ou proteína.

Question 24

Em que consiste a técnica da Reação em cadeia da Polimerase (PCR)?

Answer 24

Tecnologia que consiste na amplificação de uma região específica de DNA

Question 25

Para que serve a técnica de PCR?

Answer 25

Identificar vírus e bactérias patogênicas, identificação de indivíduos (DNA fingerprinting)