Apuntes métodos de estudio de la célula Flashcards
Qué permite disminución de límite de resolución
ir perfeccionando microscopio de luz
observar estructuras pequeñas que no se pueden ver a simple vista.
mediante qué se logra el aumento de la imagem
mediante la curvatura
de los lentes,
Qué es el poder de resolución
capacidad de distinguir separadamente 2 puntos muy cercanos entre sí
Qué permiten tinciones
aumentan el contraste entre las estructuras celulares y subcelulares, dado al escaso contraste natural que existe ellas
tinción hematoxilina‐eosina (Figura 1) tiñe estructuras basófilas y acidófilas de un color
Basófilas: púrpura‐azul (hematoxilina)
Acidófilas: tonos rosados‐rojizos (Eosina)
estructura basófila tiene afinidad por-…
colorantes básicos y, por tanto, es
ácida (como los ácidos nucleicos)
una estructura acidófila, será afín por…
colorantes
ácidos.
Núcleo y citoplasma con qué se tiñen
núcleo: hematoxilina
citoplasma: eosina
Limitaciones de microscopios ópticos de luz
Límite de resolución
Dificultad de
inferir funcionalidad a partir de la morfología celular, pues dos células pueden ser morfológicamente
muy similares, pero tener acciones muy diferentes
Qué es y cuál es el límite de resolución microscopios ópticos de luz
(distancia mínima entre 2 puntos para distinguirlos separadamente) de 0,2 micrómetros (um), determinado por la longitud de onda de la luz visible
Para qué se usa inmunohistoquímica y inmunocitoquímica y en qué se basa
para identificar diferencias moleculares entre células morfológicamente
indistinguibles,
la detección de moléculas por:
-inmunohistoquímica (en secciones de tejido)
-inmunocitoquímica (en frotis de células o células en cultivo).
se basa en especificidad de la
interacción entre un anticuerpo y un antígeno.
Cómo se obtienen anticuerpos específicos para la detección de un antígeno (proteína de interés)
1 se inyecta la moléculaque se quiere estudiar (antígeno) a animales de una especie distinta a la que se
quiere analizar
2 ; como parte de su respuesta inmune, estos animales producen anticuerpos específicos
contra el antígeno
3 , se purifica desde el suero del animal los anticuerpos para ser usado en la
detección de la molécula de interés
anticuerpo primario qué hace
reconoce específicamente al
antígeno
Qué se requiere ademàs del anticuerpo primario
sistema de visualización
un sistema de visualización es
inmunohistoquímica o inmunocitoquímica indirecta
En qué consiste inmunohistoquímica o inmunocitoquímica indirecta
consiste en utilizar un
anticuerpo secundario que se une a la región constante (fragmento Fc) del anticuerpo primario
, el anticuerpo primario, por una de sus regiones.., y por la otra….
por una de sus regiones, reconoce la proteína de interés y, a su vez,
por otra de sus regiones (Fc), actúa como antígeno del anticuerpo secundario.
Qué anticuerpo
lleva asociado el sistema de detección.
secundario
sistema de detección de anticuerpo secundario una posibilidad es que vaya “conjugado”
(asoci ado) a
una enzimaque cataliza una reacción cuyo producto sea coloreado e insoluble y, así, se
puede identificar utilizando un microscopio óptico de luz.
Qué se hace en proceso de inmunohistoquímica o inmunocitoquímica indirecta
1 se incuba el tejido o las
células con el anticuerpo primario,
2 se hacen lavados para que sólo los anticuerpos unidos
específicamente a los antígenos se mantengan unidos,
2 se incuba luego con el anticuerpo secundario,
3 se
lava nuevamente y se añade el sustrato de la enzima, generando un producto coloreado en el lugar
donde se encuentra el antígeno de interés
Qué utiliza la inmunofluorescencia
La inmunofluorescencia utiliza anticuerpos secundarios que, en lugar de estar conjugados con
una enzima, están conjugados confluoróforos (sustancias que emiten fluorescencia) que pueden ser de
distintos colores.
preparaciones con inmunofluorescencia deben ser observaas
microscopio de fluorescencia
microscopio confocal.
Qué permite la inmunofluorescencia
estudiar la distribución intracelular o
extracelular de proteínas de interés.
Qué es la PROTEÍNA FLUORESCENTE VERDE (GFP DE GREEN FLUORESCENT PROTEIN)
Se trata de una proteína producida por la medusa Aequorea victoria, que emite fluorescencia de
color verde sin necesidad de cofactores, sólo necesita oxígeno
Cómo funciona proteínas fluorescente verde
La secuencia del gen que codifica para
esta proteína puede fusionarse a la secuencia de genes que codifican para otras proteínas,
proporcionando a éstas un dominio fluorescente extra a modo de marca o etiqueta luminosa,
que sirve
para poder seguir su actividad in vivo, en tiempo rea
mediante QUÉ pueden obtenerse proteínas fluorescentes de distintos colores
mutagénesis
Diferencia entre microscopía electrónica y óptica de luz
microscopía óptica de luz permite la visualización mediante el empleo de
fotones,
la microscopía electrónica utiliza electrones, que tienen una menor longitud de onda (aproximadamente mil veces menor), lo que se traduce en una mejor resolución.
Cómo funciona la microscopía electrónica
en qué se diferencia con la óptica
la óptica emplea de fotones
la microscopía electrónica utiliza electrones, que tienen una menor longitud de onda (aproximadamente mil veces menor), lo que se traduce en una mejor resolución.
Qué permite visulaizar miscroscopìa electrónica
estructuras a nivel subcelular, como los organelos y las membranas.
Cómo funciona la MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN (MET)
Al bombardear la muestra con electrones,
las áreas o estructuras más densas: dispersan los electrones, lo que da como resultado un área oscura (electrondensa);
mientras
que en áreas menos densas: los electrones pueden pasar (o “transmitirse”) áreas menos densas, dan como resultado una región más clara (electronlúcida)
Límite de resolución de MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN (MET)
mucho menor que en la
microscopía óptica,
aproximadamente a los 0,2 nm
límite de resolución en técnicas de microscopía
electrónica de alta resolución
límite de resolución disminuye a escala atómica
Qué es MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO (MEB) y límite de resolución
tipo de microscopio electrónico capaz de producir imágenes de alta resolución de la superficie
de una muestra.
. Límite de resolución = 3 nm.
Cómo funciona la MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO (MEB)
. Antes de su observación, la muestra se recubre con un metal, de esta manera,
al
bombardear la muestra con electrones, estos chocarán con el metal desde donde se emitirán electrones
secundarios que serán registrados.
De esta manera, se genera una imagen tridimensional que representa
la superficie observada.
Cómo funciona el FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR
1 se realiza un homogeneizado (ruptura o lisis) del tejido,
2 obteniéndose el contenido celular: citosol, núcleos, mitocondrias, pequeñas vesículas denominadas microsomas producto de la ruptura y posterior sellado de las membranas celulares, etc.
3 homogeneizado se deposita en un tubo donde, a través de centrifugado, se separan los diferentes componentes según su densidad
cómo se puede lograr fracciones enriquecidas en los diversos componentes celulares
Utilizando centrifugaciones de diferentes tiempos y fuerza gravitacional (g)
qué se obtiene del fraccionamiento celular a velocidad baja, media y alta
baja: células enteras, nùcleo, citoesqueleto
media: mitocondrias, lisosomas y peroxisomas
alta: microsomas, otras vesículas pequeñas
Para qué se usa electroforesis
para separar mezclas de proteínas o de ácidos nucleicos
Cómo funciona la electroforesis
se
deposita la mezcla en una matriz porosa (gel) y se hace migrar a través de esta matriz empleando un
campo eléctrico (esta será la fuerza que impulsa el avance de la molécula por la matriz).
En el caso de
mezclas de proteínas, la distancia que cada proteína recorra o migre a través de este gel poroso en electroforesis depende
de
forma, carga y tamaño de cada una
Cuánto migran moléculas a travès de gel de electroforesis según tamaño
Las moléculas más grandes, de mayor tamaño, migrarán menor distancia ya que su
avance por la matriz es más dificultoso; mientras que las más pequeñas migrarán una mayor distancia.
Para lograr la separación de las proteínas sólo según tamaño,
se utilizan
agentes denaturantes ‐para obtener proteínas no plegadas‐ y agentes que se unen a ellas
otorgándoles carga negativa relativamente homogénea (por ejemplo, utilizando el detergente iónico
SDS);
con esto, la única variable que influirá en su migración será el tamaño molecular (peso en
kiloDalton, kDa).
Qué se hace para Para tener una referencia del tamaño de las proteínas a estudiaren electroforesis
se carga un pocillo del gel con un
marcador de peso molecular, que consiste en una mezcla comercial de proteínas de tamaños conocidos.
Qué pasa en el caso del DNA en electroforesis
En el caso del DNA, que posee carga negativa, éste migrará en el campo eléctrico hacia elpolo positivo.
los fragmentos más pequeños, recorren una distancia mayor
Para tener una referencia del tamaño de los fragmentos de DNA se carga en uno de los pocillos un marcador de tamaño con una escalera (Ladder) comercial con una mezcla de fragmentos de tamaños conocidos (diferente número de pares de bases (pb)).
Para separar proteínas qué se utiliza en electroforesis
El polímero que forma la matriz porosa generalmente corresponde a poliacrilamida y se utilizan cámaras verticales,
para separar DNA qué se utiliza en electroforesis
agarosa y se corre en cámaras horizontales
Para qué sirve el western blot
Permite detectar proteínas específicas previamente separadas mediante electroforesis.
Esto es
importante para identificar con certeza la proteína de interés.
Qué se hace para que las proteínas sean accesibles a la detección por anticuerpos en western blot
1 se transfieren desde el gel a una membrana de nitrocelulosa
2 que posteriormente se incuba con un anticuerpo primario (dirigido contra un epítope de la proteína de interés)
3 y luego con un anticuerpo secundario que reconoce la región constante (Fc) del anticuerpo primario.
Por qué va acompañado anticuerpo secundario en western blot
va conjugado por una enzima (generalmente peroxidasa) que cataliza la formación de un producto coloreado
o por a enzima que cataliza una reacción quimioluminiscente (que emite luz)
Qué pasará en lugares dnd se encuentre la proteína en western blot
En los lugares donde se encuentre la proteína, estará el anticuerpo primario, el secundario y la enzima y, por tanto, el color
Qué es el Southern Blot
Es una técnica similar al Western blot pero para detección de DNA. En esta técnica no se requieren anticuerpos.
cómo funciona el southern blot
Lo que se hace es marcar una secuencia nucleotídica o hebra de ácidos nucleicos (sonda), siendo esta hebra complementaria al material genético cuya presencia se requiere pesquisar.
La esencia de la técnica radica en aprovechar la complementariedad de bases, que es específica, permitiendo la hibridación de la secuencia que se quiere detectar con la sonda marcada con radiactividad.
Qué Northern Blot
Es una técnica similar al Western blot, pero se utiliza para la detección de RNA.
Cómo funciona Nothern Blot
Se usa una electroforesis para la separacióndel RNA por tamaño; luego se transfiere a una membrana, se incuba con una sonda específica marcada (por ejemplo, mediante radiactividad la cual se revela por radioautografía).
Qué es el PCR?
la amplificación in vitro de un fragmento específico de DNA, con le objetivo de generar múltiples copias del original.
Etapas del PCR
denaturación
hibridación
elongación o extensión
Qué pasa en la denaturación en el PCR
: Se separan las dos hebras el DNA, generalmente por calentamiento con temperaturas de 94‐95 °C.
Qué pasa en etapa de hibridación del PCR
1 Se añade a la muestra cebadores o partidores (pequeños fragmentos de DNA complementarios a ambos extremos del DNA de interés).
2 Luego se baja la temperatura a 50‐65 °C durante 10‐30 segundos en los que se produce hibridación (unión por complementariedad de bases) de los partidores con el DNA molde.
Qué pasa en la etapa de extensión o elongación en PCR
Consiste en la elongación (polimerización) de la hebra a partir de los cebadores o partidores.
Actúa la DNA polimerasa sintetizando esta hebra.
La DNA polimerasa reconocerá el híbrido partidor‐DNA molde, iniciando la síntesis de la hebra complementaria a partir del extremo 3’ libre que aporta el partidor
Qué hacen los partidores o cebadores en el pcr
los partidores determinan qué segmento del DNA será amplificado.
de qué depende la temperatura adecuada de la etapa de extensión en pcr y cuántas bases sintetizan por minuto
La temperatura de extensión depende de la polimerasa usada (para la Taq polimerasa, la temperatura óptima es 72 °C).
Típicamente una polimerasa de DNA en su temperatura óptima polimeriza unas 1000 bases por minuto.
Gracias a qué es posible técnica de pcr
Esta técnica es posible gracias a las polimerasas obtenidas de extremófilos que funcionan de manera óptima a altas temperaturas.
cuántos ciclos se realizan en el pcr
20-40 ciclos
Qué hace la técnica de manipulación génica ?
Mediante esta técnica es posible modificar la expresión de proteínas, sobre‐expresando (aumentando) o reduciendo los niveles del mRNA que codifica para ellas.
cómo se puede sobreexpresar y silenciar proteínas
. Se puede sobreexpresar incorporando a las células el DNA que codifica para la proteína de interés
Se puede silenciar la proteína utilizando RNAs interferentes que impiden la traducción o degradan el mRNA que codifica para esa proteína.
función de liposomas o vehículos virales
incorporar las secuencias de ácidos nucleicos al interior de las células.
la técnica de CRISPR‐Cas9 ha permitido…
la edición de genes , lo que promete revolucionar la capacidad de manipulación génica.
La microscopía óptica de luz permite observar la morfología de tipo…
celular e histológica
límite de resolución de microscopía óptica
0,2um (micrómetros)
para qué sirven tinciones
para que células incoloras y translúcidas sean visibles al microscopio óptico de luz
La microscopía electrónica tiene mayor poder de resolución gracias al…
uso de electrones que tienen menor longitud de ond
tipos de microscopía electrónica
de barrido y de transmisión
qué usan los inmunoensayos y para qué
Los inmunoensayos usan la especificidad de los anticuerpos para generar “tinciones” que detectan moléculas específicas.
Qué separa electroforesis y según qué
La electroforesis separa proteínas o ácidos nucleicos según su peso molecular y/o tamaño en pares de bases, respectivamente.
q permite detectar y mediante qué el western blot
Western blot permite detectar proteínas específicas mediante el uso de anticuerpos.
q permite detectar y mediante qué el southern blot
El Southern blot detecta secuencias nucleotídicas de DNA específicas mediante hibridación con sondas marcadas.
q permite detectar y mediante qué el nothern blot
El Northern blot detecta RNA específico mediante hibridación con sondas marcadas.
que hace técnica pcr
La técnica de PCR amplifica secuencias específicas de DNA
