Apuntes métodos de estudio de la célula Flashcards
Qué permite disminución de límite de resolución
ir perfeccionando microscopio de luz
observar estructuras pequeñas que no se pueden ver a simple vista.
mediante qué se logra el aumento de la imagem
mediante la curvatura
de los lentes,
Qué es el poder de resolución
capacidad de distinguir separadamente 2 puntos muy cercanos entre sí
Qué permiten tinciones
aumentan el contraste entre las estructuras celulares y subcelulares, dado al escaso contraste natural que existe ellas
tinción hematoxilina‐eosina (Figura 1) tiñe estructuras basófilas y acidófilas de un color
Basófilas: púrpura‐azul (hematoxilina)
Acidófilas: tonos rosados‐rojizos (Eosina)
estructura basófila tiene afinidad por-…
colorantes básicos y, por tanto, es
ácida (como los ácidos nucleicos)
una estructura acidófila, será afín por…
colorantes
ácidos.
Núcleo y citoplasma con qué se tiñen
núcleo: hematoxilina
citoplasma: eosina
Limitaciones de microscopios ópticos de luz
Límite de resolución
Dificultad de
inferir funcionalidad a partir de la morfología celular, pues dos células pueden ser morfológicamente
muy similares, pero tener acciones muy diferentes
Qué es y cuál es el límite de resolución microscopios ópticos de luz
(distancia mínima entre 2 puntos para distinguirlos separadamente) de 0,2 micrómetros (um), determinado por la longitud de onda de la luz visible
Para qué se usa inmunohistoquímica y inmunocitoquímica y en qué se basa
para identificar diferencias moleculares entre células morfológicamente
indistinguibles,
la detección de moléculas por:
-inmunohistoquímica (en secciones de tejido)
-inmunocitoquímica (en frotis de células o células en cultivo).
se basa en especificidad de la
interacción entre un anticuerpo y un antígeno.
Cómo se obtienen anticuerpos específicos para la detección de un antígeno (proteína de interés)
1 se inyecta la moléculaque se quiere estudiar (antígeno) a animales de una especie distinta a la que se
quiere analizar
2 ; como parte de su respuesta inmune, estos animales producen anticuerpos específicos
contra el antígeno
3 , se purifica desde el suero del animal los anticuerpos para ser usado en la
detección de la molécula de interés
anticuerpo primario qué hace
reconoce específicamente al
antígeno
Qué se requiere ademàs del anticuerpo primario
sistema de visualización
un sistema de visualización es
inmunohistoquímica o inmunocitoquímica indirecta
En qué consiste inmunohistoquímica o inmunocitoquímica indirecta
consiste en utilizar un
anticuerpo secundario que se une a la región constante (fragmento Fc) del anticuerpo primario
, el anticuerpo primario, por una de sus regiones.., y por la otra….
por una de sus regiones, reconoce la proteína de interés y, a su vez,
por otra de sus regiones (Fc), actúa como antígeno del anticuerpo secundario.
Qué anticuerpo
lleva asociado el sistema de detección.
secundario
sistema de detección de anticuerpo secundario una posibilidad es que vaya “conjugado”
(asoci ado) a
una enzimaque cataliza una reacción cuyo producto sea coloreado e insoluble y, así, se
puede identificar utilizando un microscopio óptico de luz.
Qué se hace en proceso de inmunohistoquímica o inmunocitoquímica indirecta
1 se incuba el tejido o las
células con el anticuerpo primario,
2 se hacen lavados para que sólo los anticuerpos unidos
específicamente a los antígenos se mantengan unidos,
2 se incuba luego con el anticuerpo secundario,
3 se
lava nuevamente y se añade el sustrato de la enzima, generando un producto coloreado en el lugar
donde se encuentra el antígeno de interés
Qué utiliza la inmunofluorescencia
La inmunofluorescencia utiliza anticuerpos secundarios que, en lugar de estar conjugados con
una enzima, están conjugados confluoróforos (sustancias que emiten fluorescencia) que pueden ser de
distintos colores.
preparaciones con inmunofluorescencia deben ser observaas
microscopio de fluorescencia
microscopio confocal.
Qué permite la inmunofluorescencia
estudiar la distribución intracelular o
extracelular de proteínas de interés.
Qué es la PROTEÍNA FLUORESCENTE VERDE (GFP DE GREEN FLUORESCENT PROTEIN)
Se trata de una proteína producida por la medusa Aequorea victoria, que emite fluorescencia de
color verde sin necesidad de cofactores, sólo necesita oxígeno
Cómo funciona proteínas fluorescente verde
La secuencia del gen que codifica para
esta proteína puede fusionarse a la secuencia de genes que codifican para otras proteínas,
proporcionando a éstas un dominio fluorescente extra a modo de marca o etiqueta luminosa,
que sirve
para poder seguir su actividad in vivo, en tiempo rea
mediante QUÉ pueden obtenerse proteínas fluorescentes de distintos colores
mutagénesis
Diferencia entre microscopía electrónica y óptica de luz
microscopía óptica de luz permite la visualización mediante el empleo de
fotones,
la microscopía electrónica utiliza electrones, que tienen una menor longitud de onda (aproximadamente mil veces menor), lo que se traduce en una mejor resolución.
Cómo funciona la microscopía electrónica
en qué se diferencia con la óptica
la óptica emplea de fotones
la microscopía electrónica utiliza electrones, que tienen una menor longitud de onda (aproximadamente mil veces menor), lo que se traduce en una mejor resolución.
Qué permite visulaizar miscroscopìa electrónica
estructuras a nivel subcelular, como los organelos y las membranas.
Cómo funciona la MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN (MET)
Al bombardear la muestra con electrones,
las áreas o estructuras más densas: dispersan los electrones, lo que da como resultado un área oscura (electrondensa);
mientras
que en áreas menos densas: los electrones pueden pasar (o “transmitirse”) áreas menos densas, dan como resultado una región más clara (electronlúcida)
Límite de resolución de MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN (MET)
mucho menor que en la
microscopía óptica,
aproximadamente a los 0,2 nm
