8- Préparation/Purification protéines Flashcards
Principe chromato echange d’ions
Séparation par l’interaction entre ions dee charges opposées
augmentation de la charge nette de la prot = augmentation de l’adsorption à la résine
Comment faire la désorption
1) Diminuer charge nette par chgmt de pH
2) Augmenter la concentration d’ions compétitifs (ex: NaCl ou KCl) + il y a de charges + il faut du sel
Étapes chromato par échange d’ions (3)
1) étape d’équilibation (tampon d’équilibration)
2) application de l’échantillon (tampon de lyse, contaminants charge nulle et charge +)
3) élution par gradient (tampon avec augmentation graduelle de sel = charges de plus en plus négatives sortent)
4) regénération (tout sort)
Avantages (5) et désavantages (3) chromato échange d’ions
Avantages: méthode très flexible (pH et sel), choix entre échangeur + ou -. bcp de résines différentes, résines pas cher, purif avec détergents sans charge et en présence d’urée
Désavantages: méthode pas très spécif, pas possible d’utiliser la guanidine car chargée, chromato avec deux pompes nécessaire pr performance (par gradient)
Principe de chromato par filtration sur gel
Séparation basée sur taille moléculaire, gel poreux et protéines pénètrent
Les protéines sont partitionnées entre la phase mobile et la phase stationnaire (résine ou gel)
ordre d’élution
prot sans accès > prot avec accès partiel > prot ++ petite avec meilleur contact aux pores
Étapes de chromato par filtration sur gel
1) étape d’équilibration (tampon d’équilibration)
2)Application de l’échantillon (tampon d’application, but: minimiser quantité d’échantillon qui passe par les billes)
3)étape d’élution (tampon d’élution: prot sans accès au pore passent en premier, suivi de prot accès partiel, suivi de petites prot)
Avantages (5) et désavantages (3) de la chromato par filtration sur gel
Avantages: bcp de résines différentes, résines pas chères, purification avec détergents et en présence de dénaturants, bonne méthode pr corps d’inclusion, équipement pas cher et possible avec élution linéaire
Désavantages: pas bonne pr grandes quantités de prot, résines pas durables, vitesse d’écoulement très faible
Principe de la chromato en phase inverse
La séparation est basée sur les interactions hydrophobes (phase mobile polaire, phase stationnaire apolaire)
L’adsorption des protéines est en équilibre réversible et varie selon la polarité du solvant
Désorption de protéines avec solvant organique.
Étapes chromato en phase inverse
1) étape d’équilibration (tampon d’équilibration avec très faible concentration de solvant orga)
2)application échantillon (tampon équilibration, contaminants très polaires sortent)
3)étape d’élution (élution par gradient = augmentation de la concentration du solvant orga, élution du - au plus hydrophobe)
4) régénération (tampon 100% orga pr tt sortir)
types de colonne pr chromato en phase inverse
Colonne C 8 en silice
