11- Cryo-ME

Question 1

Pk ME?

Answer 1

e- = Bcp plus petite longueur donde visible que photons

Question 2

comment on forme image en ME

Answer 2

electrons = diffuser

chgmt de phase produit image

contraste = image

Question 3

comment on forme le contraste?

Answer 3

les e- diffuses par le specimen interferent causant contraste + et -

on appelle ca le defocus

Question 4

cest quoi la fonction de transfert de contraste? (CTF ou Contrast Transfer Function)

Answer 4

aberrations dans un ME qui modif limage dun echantillon.

CTF degrade image (on veut la corriger)

Question 5

CTF defocus et resolution

Answer 5

a basse freq = bcp de CTF (peu de contraste)

pr remedier au CTF on augmente defocus (augmente contraste ms diminue Res)

Question 6

Analyse de particules uniques APU

Answer 6

pour voir une macromolecule en 3D le ME prend des milliers de photos 2D et les construit ensemble pour voir 3D

molec + grandes = grand contraste donc echantilon ideal

Question 7

Quelles tailles de molecules peuvent etre analysees par APU

Answer 7

Proteines > 50 kDa

Proteines membranaire > 30 kDa

Question 8

Classifiez les echantillons les + adaptes pour la ME

-prot de 30kda
-prot membranaire de 30kda
-complexe proteique de 500kda
-complexe ARN-proteine de 2000kda

Answer 8

complexe prot
prot membr
prot
complexe ARN-prot (ARN dur a vitrifier et a colorer)

Question 9

Coloration negative vs Cryo-ME

Answer 9

coloration negative:
-utilisee pour augmenter le contraste (prot = blanches)
-peu dimages (car bcp de contraste)
- resolution limitee

cryo-ME:
-particules sont dans la glace vitrifiee (congelation)
-bcp dimages collectees
-resolution limitee par aberrations CTF

Question 10

preparation echantillon pr APU coloraation neg vs cryo me

Answer 10

qq microlitres de macromolec EN SOLUTION ajoutee a grille ME

pr coloration neg = carbone continu

pr cryo-ME = carbone perfore pr visualiser slm glace

Question 11

PK ARN pas colore en ME coloration neg

Answer 11

coloration = metaux lourds qui augmente contraste

ARN peu de contraste car par forme de groupements riches en electrons

Question 12

Pourquoi vitrification? comment?

Answer 12

glace cristalline pas transparente on voit rien

on utilise ethane liquide car tres haut taux de refroidissement (refroidit vite = pas formation cristaux)

Question 13

Pourquoi faire dosage delectrons?

Answer 13

Car electrons font dommage aux molecules.

Question 14

Que font les electrons lorsquils touchent la glace?

Answer 14

induisent du mouvement dans la glace = rendent image floue

Question 15

pourquoi le DED (detecteur direct electron) peut corriger les images?

Answer 15

BCP images par secondes = corrige le flou, augmente res

Question 16

cest quoi classification 2D

Answer 16

aligne les particules en 2D pr reveler les diff orientations de la particule

Question 17

Comment est mesuree la resolution dune reconstruction 3D?

Answer 17

par la correlation de sphere de Fourier (FSC)

elle mesure correl entre 2 reconstructions independantes

lorsque la correlation passe sous 0.5 ou 0.143 cest la resolution min de la structure (1/A)

Question 17

Compare les techniques de biologie structurales : RMN cristallographie R-X et Cryo-ME (APU) photo