12- Interactions macromolec

Question 1

In vivo quels facteurs sont importants a considerer pour la formation de complexes? (5)

Answer 1

1- conditions physico chimiques (densite macro, sels, pH, T)
2- bon repliement des macromolec
3- compartimentalisation cellulaire et accessibilite macromolec avec ligands
4- modifications covalentes des macromolecules (phosphorylation, acetylation, ubiquitination, etc)
5-presence de cofacteurs impliques dans la liaison ou activite

Question 2

techniques pr determiner interaction proteine proteine in vivo (4)

Answer 2

co immunoprecipitation/ co ip MS/ etiquettes
marquage par proximite streptadivine
double hybride
methode de complementation PCA

Question 3

que fait la co-immunoprecipitation (co-IP)

Answer 3

utilisee pour verifier si deux molecules interagissent

1-lyse cellulaire pr sortir proteines et on denature les prot par SDS => electrophorese gel acrylamide => select proteine A et B
2- on select proteine A par anti corps anti A
3- on fait precipiter et si proteine B liee elle co precipite avec proteine A

Question 4

pour demontrer une interaction co-IP + avantages et inconvenients)

Answer 4

avoir une hypothese de lidentite de A et B
avoir les anticorps anti A et anti B
interaction stable en presence du detergent pr la lyse

A: demontre interaction de proteines endogenes

I:
dur de faire ac
on sait pas si interaction directe ou indirecte
faux positifs par processus de lyse

Question 5

Cest dur de faire des anticorps specifiques pour une proteine. Que pouvons nous faire pour y remedier

Answer 5

Utilliser etiquettes sur proteine et ces etiquettes ont des anticorps

avantage: on reutilise etiquette
deux etiquettes = double purification

inconvenient: etiquette peut masquer site liaison (faux positif) ou creer un nouveau site artificiel (faux positifs)

Question 6

Comment detecter les proteines co-precipitees

Answer 6

methode Co-IP + criblage haut debit MS (on purif par affinite)

Question 7

Avantages et desavantages de detection des proteines Co-IP avec SM

Answer 7

Avantages: on peut identifier gene des peptides connus

Inconvenients: faux positifs, fragments hydrophobes ne peuvent pas etre identifies

Question 8

Cest quoi un essai de marquage par proximite a la streptadivine + avantage desavantage

Answer 8

streptadivine a enorme affinite avec biotine (enrichissement a la biotine)

Avantages:

on determine les proteines a proximite de la prot dinteret ds cellule avant la lyse

permet de determiner la localisation cellulaire de notre proteine indirectement

Desavantages: ne determine pas les interactions entre les proteines dinterets juste la distance

faux + et - a cause de la ligase

Question 9

Explique le concept de double hybride + avantages et inconvenients

Answer 9

2 mutants : proteine cible A (appat) fusionnee avec domaine de liaison a l ADN dun activateur transcriptionnel

proteine B (proie) fusionne avec domaine activateur dun activateur transcriptionnel

Ces gènes recombinants sont introduits dans la levure. Si les protéines hybrides interagissent, la transcription du gène rapporteur est activée, permettant la détection par la croissance des colonies de levure.

Avantages: interactions detectees sont directes

Desavantages: plusieurs faux positifs en raison de la surexpression de proteines de fusion chez la levure (fusion de proteines pas rapport)

Question 10

Explique la methode de complementation de fragments proteiques (PCA) + avantages et desavantages

Answer 10

proteine rapporteur divisee en 2 et frag associes a 2 prot, lorsque il y a interaction entre 2 prot, rapporteur assemblee

avantages: permet etude interactions in vivo (niveau expression endogene)
divers types cell, diverses applications

desavantage: tendance a lauto assemblage des fragments proteique
proteines fusion peuvent fr faux + et faux -

Question 11

interactome definition

Answer 11

ensemble interactions molec ds cellule

Question 12

affinite vs specificite

Answer 12

affinite = force interaction Ka grand Kd petit
specificite = capacite a lier un ligand preferentiellement par rapport a un autre

Question 13

3 methodes de verification dinteraction directe

Answer 13

resonance plasmonique de surface (SPR)
calorimetrie a titrage isotherme
retard sur gel

Question 14

cest quoi la SPR

Answer 14

methode permettant de detecter interact avec ligand en tps reel

ligand retenu de maniere specif a biocapteur

analyte dilue ds tampon circ a flux constant sur surf du biocapteur

association et dissociation des complexes modif angle de lumiere reflechie

sensorgramme capte le signal de resonance

Question 15

avantage desavantage SPR

Answer 15

temps reel
applicable a bcp de types de molec
on peut etudier plus de deux partenaires
on peut trouver K association/dissociation et k association/dissociation)

immobilisation molec sur surf put interferer avec activite
ne permet pas homogeneite echantillon

Question 16

c quoi la calorimetrie a titrage isotherme

Answer 16

methode permettant de mesurer chaleur generee ou abs par interaction molec

sln de ligand titree avec sln partenaire = chaleur produite ou absorbee

syst mesure changement de temperature entre cell de ref et cell experimentale

Question 17

avantages desavantages calorimetrie

Answer 17

methode par excellence

on peut determiner tous les parametres en une seulle experience
methode directe
pas de marquage

on ne peut pas trouver les parametres is la difference denthalpie est nulle
peut necessiter bcp materiel
ne permet pas homogeneite echantillon

Question 18

c quoi retard sur gel electrophorese

Answer 18

modele standard delectrophorese

retard = interaction ARN-prot ADN-prot

concentration ARN relativement faible

Question 19

avantages desavantages retard sur gel

Answer 19

simple peu couteux
on peut determiner KD directement
peut reveler plusieurs complexes
peut verifier homogeneite conformationnellle

ARN doit etre marque
difficile a realiser avec petits peptides
complexes instables durs a detecter