6- Structure tertiaire acides nucléiques Flashcards
Quelles sont les forces qui stabilisent la structure secondaire de l’ARN
liaison hydrogène et empilement des bases. très stables et favorisent la formation de doubles hélices
Quelles sont les forces qui stabilisent la structure tertiaire de l’ARN (3)
-Structure des régions non pairées
-Empilement coaxial: empilement bout à bout des doubles hélices
-Autres interactions tertiaires pour empaqueter les hélices (mg2+ pr neutraliser charges - du phosphate)
Les structures 3D sont elles plus ou moins stables que les structures secondaires?
Généralement moins stables.
Dans les doubles hélices d’ARN (domaines hélicaux), où se retrouvent les charges négatives des phosphates ?
À l’exterieur en contact avec le milieu aqueux.
Rôle des ions métalliques dans la formation des structures tertiaires de l’ARN ?
Les ions métalliques tel Mg2+ neutralisent les interactions de répulsion entre les charges -.
(Formation structure tertiaire = rapprochement domaines hélicaux chargés - )
Hélices à double brin régulières (3)
A: Double hélice d’ARN avec pb WC et G-U
B: pas chez ARN
Z: Observée pour les séquences rCrG en haute concentration de sel (6 M NaClO4)
Nomme des motifs structuraux se retrouvant dans les régions non-pairées de l’ARN (5)
1- simple brin
2- extrémités hélices (5’ ou 3’ libre)
3- boucles terminales (dans les épingles à cheveux)
4- boucles internes (renflements, boucles symmétriques/asymmétriques)
5- jonction (à 2,3,4 tiges)
Conditions des régions simple brins (3)
1- Basse T et haute [sel]* : bases s’empilent, ribosent adoptent conformation C3’-endo et la forme hélicoïdale est droite
*sel stabilise charges partielles
2- Haute T et basse [sel]: - empilement (peu coopérativité)
3- Tendance à l’empilement A, G > C > U
Caractéristiques des extrêmités des hélices (3)
1) Les prolongements simple brin d’une hélice (nucléotides non appariés) stabilisent les duplexes.
5’- GACUGC A - 3’
||||| |
3’- CUGACG - 5’
2) Les prolongements à l’extrémité 3’ sont thermodynamiquement plus stables que ceux en 5’.
3) Les purines (A, G) stabilisent généralement plus que les pyrimidines.
Séquence et Caractéristiques des boucles terminales : motif U-turn (3)
Séquence consensus: UNR (N= n’importe quel nucléotide et R= purine)
Boucle commune dans lanticodon de ARNt et ARNr
Caractéristiques structurales:
1) Pont H entre ribose de U et R
2) Pont H entre U et phosphate de R
3) Angles du squelette particuliers entre U1 et N2
Caractéristiques des boucles terminales: tétra-boucles (4)
-Chez les ARNr
-GNRA, UNCG, CUYG
-forment struct compactes, rigides et stabilisantes.
-N et Y = variable donc + flexible
Caractéristiques des boucles GNRA (6)
1- G-A (trans G sillon mineur / A Hoogsteen ou sheared G-A)
2- Pont H entre G et phosphate de R
3- Pont H entre ribose de G et N
4- Empilement NRA = optimal si N = R
5- Tournant abrupte entre G et N
6- C3’-endo pour G et A, C2’-endo pour N et R pour augmenter distance P-P entre nucléotides adjacents et permettre boucle
*similarité avec motif U-turn
Importance boucles GNRA
Rôle important reconnaissance de l’ARN et reconnaissance des protéines
Caractéristiques des boucles CUYG
-Fermée par G-C , séquence consensus G1C2U3Y4G5C6 (GCUYGC)
Caractéristiques structurales:
1) C2-G5 WC donc boucle à deux nucléotides
2) U dans le sillon mineur et intéragit avec G1 G5 et C6
3) CUYG sont C2’-endo
Caractéristiques des boucles UNCG
-exceptionnellement stables si C-G ferme boucle
-UNCG peut remplacer GNRA sans affecter fct
-Caractéristiques structurales (très différentes de GNRA):
- U-G (G est syn)
- Pont H entre C et le phosphate de U
- C empilé sur U
- U,G C3’-endo N,C C2’-endo
Caractéristiques des boucles internes: les protubérences
- Les protubérences sont des boucles internes à 1-2 nuc sur 1-2 brins.
-protubérence à un nuc: intercale ds hélice ou se retourne vers l’ext
-exemple protubérence à 3 nuc: ARN TAR du VIH
Caractéristiques des boucles Internes:
Paires de Bases Non-Canoniques
Boucles internes symétriques à 2 nuc: souvent pb non-canon.
déstabilisent les hélices d’ARN.
Elles créent des distorsions dans l’hélice de type A qui deviennent des sites potentiels pour des ligands (métaux divalents, protéines, etc.).
Boucles internes symétriques à 4 nuc: souvent pb non-canon.
Ces tandems de paires de bases non-canoniques stabilisent ou déstabilisent les hélices d’ARN. L’ordre de stabilité est: 5’-UG- 3’/3’-GU-5’(-4.8 kcal/mol) > GU/UG > GA/AG
-Parmi les + stables sont les empilements de purines interbrins.
Caractéristiques de l’empilement de purine inter-brins
Empilement G/G soit G-U wobble soit A/G sheared.
Caractéristiques des boucles internes asymétriques
Certaines boucles internes asymétriques forment des structures stables (boucle E) et d’autres flexibles.
Souvent pb non-canoniques
Caractéristiques du motif boucle E
(E loop)
Sous catégorie à Motif à bulge G ( N=g)
Très conservé chez l’ARN 5S des eucaryotes
-Empilement A-A de brins parallèles
-Pb non canoniques G-A, triplet de bases G-U-A
-Squelette ribose-p très déformé
Caractéristiques des jonctions (3)
Les jonctions jouent un rôle important dans le positionnement de domaines hélicaux et déterminent la conformation globale des molécules d’ARN.
L’empilement coaxial entre 2 hélices stabilise les jonctions.
Bsn de métaux divalents pour stabiliser les phosphates.
3 méthodes de base pour la prédiction de structures secondaires:
-Calcul thermodynamique ou méthodes du minimum d’énergie libre:
Détermine la structure de régions complémentaires qui sont énergétiquement stables (exemple: Mfold, Vienna package, Sfold, RNAstructure)
Analyse comparative de séquences (ou analyse de co- variation):
Prend en compte les patrons de paires de base conservés durant l’évolution (exemple: Turbo Fold).
Methodes biochimiques sur la connaissance (knowledge-based;)
exemple MC-Fold/MC-Sym, CONTRAfold
méthodes biochimiques
Que permettent les études de dénaturation à la chaleur avec des oligoribonucléotides (thermodynamique de l’ARN)
1) permettent de mieux comprendre les énergies impliquées dans la formation des structures d’ARN et
2) aident à la prédiction de structure
Énergie d’empilement totale
Somme d’énergies d’empilement + énergie libre d’initiation +4.10 kcal/mol
Vrai ou Faux. La présence de boucles internes, terminales ou bulges n’est pas favorable au repliement et augmente le delta G de repliement.
Vrai.
Vrai ou Faux. GNRA et UNCG sont moins déstabilisantes que d’autres boucles.
Vrai.
Pourquoi les calculs de Mfold ne permettent pas de prédire la structure en toute confiance?
On n’inclut pas tous les facteurs (effet du sel, stabilisation de certaines boucles, etc.)
Que permet de faire l’Analyse comparative des séquences?
Prédire les structures secondaires et certains éléments de structures tertiaires de l’ARN.
Cette méthode est basée sur la conservation de structure pour une même fonction (séquences apparentées comparées)
Que permettent de faire les méthodes biochimiques pour sonder la structure?
Faire des coupures ou modif sur l’ARN libre ou lié à partir de composés chimiques et d’enzymes pour obtenir la séquence et la structure secondaire de l’ARN.
Étudier le repliement des ARN dans différentes conditions.
Avantages et inconvénients des nucléases
- actives dans des conditions dénaturantes (5 M urée)
-détermination de structure sec dans conditions semi-dénaturantes (ex: absence ions magnésium)
-grosse taille des nucléases entraîne encombrement stérique chez gros ARN donc permet pas dét structure tertiaires.
Attaque de l’ARN par composés chimiques (3)
1- réactifs des bases: permettent de distinguer bases appariées/non appariées
2- réactifs du squelette ribose phosphate: pas sensibles à struct primaire ou sec. permettent de cartographier les sites accessibles et enfouis chez les gros ARN repliés
3-agents de pontage: composés chimiques réagissant avec 2 cibles rapprochées permettant l’identification d’interactions tertiaires
Deux méthodes d’Attaque de l’ARN par composés chimiques
1) détection du clivage de squelette ribose phosphate d’un ARN marqué au 32P
2) détection d’une modif chim ne causant pas le clivage du squelette. détection se fait par extension d’une amoce marquée au 32P à l’aide de la reverse transcriptase.
Méthode moderne SHAPE
Composé chimique permettant l’acylation du 2’-OH du ribose = grande flexibilité = permet de trouver la structure secondaire d’ARN.
Étude génomique in vitro et in vivo
Utilisation de sondes chimiques ou enzymatiques pour analyser les ARNm des organismes.
