7- Expression protéines Flashcards
Différents types d’application de purif de protéines (4)
1- étude d’activité
2-structure
3-application industrielle
4-application thérapeutique
Facteurs spécifiques à une protéine
1-Localisation ds cell
2-propriétés physicochimiques (PM, pI, liaison, glycolysation, phosphorylation, méthylation, etc)
Sources de protéines les plus étudiées
1- tissus animaux
2- bactéries (E.coli)
3- Levures (pichia pastoris)
4- c. insectes
5- c. humaines (HEK293-E6)
Avantages (3) et limites (4) expression des protéines animales
Avantages:
1-protéine native
2-modifications post-traductionnelles
3-pas cher
Désavantages:
1-sources limitées
2-petite quantité de prot spécif
3-pas de tag
4-pas tjr reproductible
Étapes Expression des protéines dans les bactéries (4)
1-construction vecteur
2-selection avec antibiotique
3-culture et induction de la protéine
4-purifier et analyser
Avantages (4) et limites (3) expression des protéines bactérie
Avantages:
1-bcp protéines et pas cher
2-culture et expression rapide
3-bcp vecteurs expression différents (tags)
4- expression de protéines marquées
Limites:
1-pas modif post trad ou de ponts disulf
2-pas bon pour protéines membranaires (esp chez l’humain)
3- différents codons chez la bactéries
Comment résoudre le pb des codons rares chez les bact.?
1-synthèse avec optimisation de codons
2-utiliser ARNt exprimant les codons rares de la bact
Avantages (3) et désavantages (3) expression des protéines levure
Avantages:
1- bcp de protéines, pas cher
2-ponts disulf et modif post trad (phosphorylation)
3-expression de prot marquées
Désavantages:
1-moins rapide que bact
2-diff codons
3-pas bonnes pr protéines glycosylées
Avantages (4) et limites (3) des protéines insecte
Avantages:
1-ponts disulf, modif post trad
2-très bon pr protéines glycosylées
3-vecteurs his-tag et gst-tag
4-meilleurs codons pour grosses protéines humaines
Limites:
1-pas rapide
2-milieux spéciaux + cher
3-production de protéines marqués difficile
Expression dans les cellules humaines (vect, cell)
Vecteur pTT:
-pour expression intracell ou secretion extracell
-10x plus efficace que pCDNA
-peut produire de 20 à 60 mg de protéine recombinante par L
-fait protéines avec His-TAG
Cellules HEK:
-pas pb de codon rare
-chaperons pour un repliment optimal
-possibilité de densité cell + élevée
Avantages (4) et limites (4) expression dans les cellules humaines
Avantages:
-ponts disulf, modif post-trad et protéines membranaires
-protéines ne sont pas immunogènes
-vecteurs production His-tag
-meilleurs codons
Limites:
-pas rapide
-besoin d’un fermenteur pr grosse prod
-milieux spéciaux = cher
-production de protéines marquées est impossible
Schéma général de purif
Suspendre et lyser cellules par centrifugation= surnageant + culots
Surnageant centrifugé = protéines solubles = purif illimitée
Culots centrif+détergent (prot mal repliée + lipides) = corps d’inclusion (juste prot mal repliées) —> solubilisation avec agent dénaturant (urée ou guanidium) = purif limité —> renaturation avec tampon physio et essais bio
3 grandes étapes purif
1-isoler et concentrer (sal, aff, ion)
2-retirer grosses impur (aff, ion)
3-retirer petites impur (gel, phase inv)
Tampons pour purification (6)
1-tampon physio pH 6-9 (stabilité prot)
2-tampons tris-HCl, phoshate, HEPES (maintenir pH phsyio)
3-sels: NaCL, KCl (solubilité, stabilité)
4-dénaturants (urée, guanidium)
5-inhibiteurs de protéases
6-antioxydants: DTT et BME (rompent ponts disulf)
Concept de la précipitation saline des protéines
resuspendre chq culot contenant les prot ayant une concentration graduellement + grande de sel et voir sur électrophorèse pr identifier les prot.
chq protéine a différente interaction avec sulfate d’ammonium et aura bsn d’un certain % pr précipiter (méthode semi-sélective)
4 Méthodes les plus communes de chromatographie
1- chromato d’affinité
2- chromato d’échange d’ions
3- chromato par filtration sur gel
4- chromato en phase inverse
(1,2,3 conformation native et 4 conformation dénaturée)
Élution linéaire vs par gradient
linéaire = 1 tampon, - cher, + rapide, séparation -efficace
par gradient = plsr tampons, + cher, - rapide, sép + efficace
Détection du signal
Détection par UV de l’absorbance
A= E l C
Groupements importants pour l’absorbance des protéines
-Amides et chaînes lat des aa (<250 nm)
-aa aromatiques (>250 nm)
Filtres UV importants (3)
210 à 230 : amides et aa ( le + sensible)
250 : phe, tyr et trp (- sensible)
280: seulement typ et trp
Principe chromato d’affinité
Liaison spécif entre protéine et résine qui est facilement réversible. On exploite une propriété biochimique spécif de la prot d’intérêt.
2 types de protéines purifiées par chromato d’affinité
Protéines natives: ATP, NADP, Métaux
Protéines de fusion: GST, HIS
Rôle du bras espaceur
Minimise liaison entre la matrice et les protéines
Étapes de l’élution
1- étape d’équilibration (pas de signal les particules passent sur la résine)
2-étape de liaison (les particules non liées sortent)
3-étape d’élution (les protéines d’intérêt éluent, compétiteur prend la place sur la résine)
Protéine de fusion de la GST
GST + Prot –> GST lie le glutathion –> glutathion en excès prend place de GST-prot–> GST-prot hydrolysé pr libérer protéine
Avantages et désavantages fusion GST
avantages: augmente solubilité prot, purif facile, elution facile
desavantages: grosse etiquette, pas purif en presence de denaturant, pas bon pr essais bio car GST forme dimere
Pourquoi on veut couper prot de fusion
protéine trop grosse
de plus le sit de coupure est deja inclus dans le vecteur sélectionné pour l’expression de la protéine
Protéine de fusion poly-His
prot-His –> His lie nickel –> Imidiazole élue prot-his –> hydrolyse protéine
Avantages et desavantages de fusion poly-his
avantages: purif facile, elution facile, purif possible avec denaturants, petite etiquette (6 aa)
desavantages: augmente formation corps inclusion, purif pas possible avec antioxydants, pas bon pr prot qui lient métaux de transition
Dialyse
Séparation par membrane semi-perméable diffusion des petits contaminants.
