5. Epigenetica

Question 1

Cos’è la RNA interference?

Answer 1

È un processo di inibizione, innescato e promosso dai miRNA, piccoli dsRNA capaci di inibire/ degradare l’mRNA

Question 2

Cosa sono i miRNA?

Answer 2

Sono dei segmenti di dsRNA, lunghi 20-30nt, ottenuti dal processamento di un lungo dsRNA (gene policistronico trascritto dalla pol II)

Si classificano in:
- Intergenici → situati al di fuori delle regioni igieniche
- Intragenici → ospitati all’interno di altre unità geniche

Per essere funzionalmente attivi devono essere associati alle proteine argonauta, RISC = argonauta + miRNA

Question 3

Descrivi la biogenesi dei miRNA

Answer 3

1) pri-miRNA = trascritto primario, ha una porzione che si ripiega a forcina
2) Microprocessore = drosha + DCGR8
Drosha = endonucleasi che processa il pri-miRNA → resta solo la forcina con l’ansa = pre-miRNA
DCGR8 = cofattore di drosha, permette il corretto posizionamento dell’endonucleasi rispetto al loop della forcina
3) L’ esportina-5 trasporta il pre-miRNA fuori dal nucleo
4) Dicer (= RNAsi) Taglia a 20 nt di distanza dal sito di drosha rimuovendo l’ansa
→ si ha un dsRNA con 2 overhang alle estremità 3’
5) Formazione pre-RISC = argonauta + dsRNA → Separazione dei due filamenti di RNA

Question 4

Come decide il RISC quale filamento di dsRNA eliminare per ottenere il miRNA guida?

Answer 4

Il futuro miRNA guida è quello che presenta più mismatch al 5’

Question 5

Come avviene la target reconigtion tra miRNA e mRNA da degradare?

Answer 5

È detto appaiamento a complementarietà supplementare
Non è necessario un appaiamento perfetto di tutto il miRNA, ma solo della seed sequence, al 3’UTR del mRNA

Question 6

Cos’è la seed sequence dei miRNA?

Answer 6

Unica porzione del miRNA in cui la tolleranza di mismatch con l’mRNA è minima
Seq che va dal 2° al 7° nt

Question 7

Come agiscono i miRNA?
(2 scopi)

Answer 7

• Inibizione della traduzione:
  il RISC lega il 3’UTR → l’argonauta fa ingombro sterico → no riciclo ribosomi
• Degradazione dell’mRNA:
  il RISC recluta prot di decapping + prot che inducono la deadenilazione dell’mRNA

Question 8

Cosa sono i P-bodies?

Answer 8

Sono compartimenti cellulari in cui si accumulano nei complessi RISC-mRNA bersaglio, i complessi possono liberare l’mRNA al bisogno

Question 9

Per cosa vengono usati i miRNA?

Answer 9

• Transizioni che prevedono cambiamenti drastici dell’espressione genica → i miRNA collaborano coi TF
• Come stabilizzatori → i miRNA mantengono un determinato programma di espressione genetica

Question 10

Quali sono le caratteristiche dei siRNA?

Answer 10

Sono segmenti di dsRNA complementari alla coding sequence dell’mRNA
Vengono trasfettati direttamente nel citosol dove possono richiedere Dicer o essere direttamente complessati agli argonauti

Question 11

Che cos’è il nuclear transfer?

Answer 11

È il trasferimento del nucleo di una cellula somatica in un ovocita privato del genoma

Inserendo poi l’ovocita “trasferito” in una Foster Mother l’individuo che nasce è il clone della cellula donatrice; è detto somatic cell nuclear transfer

Question 12

Cosa sono le iPS cells?

Answer 12

= induced pluripotent stem cells
Sono delle cellule somatiche trasformate in cellule ES

Question 13

Quali sono e a cosa servono i fattori di trascrizione della pluripotenza?

Answer 13

Sono dei fattori di trascrizione che permettono di convertire una cellula somatica in una staminale
Ne esistono quattro fondamentali: Oct4 + Sox2 + klf4 + Myc = OSKM
Myc è un oncogene, viene poco usato, sono sufficienti gli altri tre che vengono detti TF pionieri

Question 14

Quali sono le caratteristiche dei complessi di rimodellamento della cromatina?
(3)

Answer 14

• Hanno almeno una subunità ATPasica
• Possono agire sia in senso positivo (rilassando la cromatina) che negativo ( compattando la cromatina)
• Non hanno un dominio analogo al binding domain dei TF, necessitano quindi di TF pionieri che gli “indichino la direzione”
  !! TF pionieri ≠ TF che attivano la trascrizione !!

Question 15

Quali sono le possibili modalità d’azione dei complessi di rimodellamento della cromatina?
(3)

Answer 15

• Staccano un breve tratto di DNA per srotolarlo ed esporlo ai TF
• Spostano il nucleosoma
• Rimuovono un intero nucleosoma

Question 16

Che proteine sono coinvolte nella modifica post traduzionale degli istoni?

Answer 16

• Writers → aggiungono la modifica
• Readers → leggono e interpretano la modifica
• Erasers → rimuovono la modifica

Question 17

Quali sono le possibili modificazioni post traduzionale degli istoni?

Answer 17

Tutte le modificazioni vengono fatte sulla coda N- term dell’istone

• Acetilazione:
  ~Writer = HAT (= acetil transferasi)
  ~Reader = prot con un bromodominio che forma una tasca in cui può alloggiare una lys acetilata
  ~Eraser = HDAC (= deacetilasi)
  È un meccanismo fortemente associato all’attivazione della trascrizione
• Metilazione
  ~Writer = HMT (= metil transferasi)
  ~Reader = prot con un cromodominio che riconosce e lega le lys solo se metilate
  ~Eraser = demetilasi
  Ha f.ne variabile dipende dagli aa metilati:
  a. Attivazione → metilazione di H3K4 + H3K36
  b. Repressione → metilazione di H3K9 + H3K27
• Fosforilazione:
  Aggiunta di cariche meno che altera la basicità delle code istoniche → perdita di affinità DNA
  Ha funziona attivatoria

Question 18

Quali sono le regole sul funzionamento delle modificazioni degli istoni?
(5)

Answer 18

a. Writers + erasers non riconoscono nel dna e vengono reclutati da TF specifici
b. Le modificazioni sono stabili e reversibili
c. Le modificazioni sono ereditarie
d. Le modificazioni possono propagarsi
e. In una stessa regione le modificazioni sono coerenti tra loro

Question 19

In cosa consiste la metilazione del DNA?

Answer 19

È una modifica covalente, a scopo inibitorio, che non modifica le basi l’informazione genica e che avviene solo sulle citochine delle isole CpG

Question 20

Che enzimi sono coinvolti nella metilazione del DNA, a livello delle isole CpG?

Answer 20

• DNA metiltransferasi de novo → scrivere a prima metilazione in un’isola CpG
• DNA metiltransferasi di mantenimento → rendono i siti emi-metilati completamente metilati
  È l’enzima deputato all’ereditarietà in mitosi della metilazione

Question 21

Come avviene la demetilazione?

Answer 21

Non esistono enzimi demetilanti
2 metodi:
- Demetilazione positiva → Viene inibita la prod della DNA metiltransferasi di mantenimento
- Meccanismo enzimatico attivo di demetilazione
a. Gli enzimi della famiglia delle TET convertono in 5-idrossimetilcitosina la 5-metilcitosina
b. 5-idrossimetilcitosina vista come sbagliata → sottoposta al base excissor repair
→ 5-idrossimetilcitosina rimossa + sostituita con una citosina non metilata

Question 22

Cosa comporta il passaggio eu→eterocromatina?

Answer 22

• Sostituzione dei marker istonici
• Metilazione del DNA
• Compattamento dei nucleosomi

Question 23

Cos’è l’imprinting genomico?

Answer 23

È una forma di regolazione genica per cui di alcuni geni è espresso solo un allele in modo specifico secondo l’origine parentale
- Imprinting materno → allele materno off
- Imprinting paterno → allele paterno off

Question 24

Come sono organizzati i geni soggetti a imprinting?

Answer 24

Sono organizzati in cluster contenenti:
-Geni soggetti a imprinting materni + paterni
- ICR = regione, che può essere metilata, che controlla l’espressione dei geni soggetti a imprinting

Question 25

Descrivi l’imprinting dei geni Igf2 e H19?

Answer 25

• Igf2 è a imprinting ♀
  H19 è a imprinting ♂
• CTCF =TF legante ICR non metilata
  Reprime la trascr di Igf2 + permette la trascr di H19 → è presente sull’allele materno
  → allele paterno = ICR metilato + non c’è CTCF +

Question 26

Come varia la metilazione embrionale?

Answer 26

a. Ovocita + spermatozoo → molto metilati
b. Genoma ♂ → demetilazione rapida col meccanismo enzimatico attivo
Genoma ♀→ demetilazione lenta con demetilazione passiva
c. Morula → metilata pochissimo
d. Blastocisti → sono riscritte le modificazioni epigenetiche

Question 27

Da cosa sono garantiti i loop di croamatina?

Answer 27

-Coesine → mantengon vicini i segmenti grazie alla loro struttura ad anello
- lncRNA → con la loro struttura 2° riescono ad interagire con le prot alla base del loop

Question 28

Descrivi le globine

Answer 28

Sono un locus regolato da loop dinamici
Lo stesso locus codifica per le globine ε (embrionale) + γ (fetale) + δ+β (adulto), l’espressione di una delle globine è data da LCR (= locus control region) + interazione LCR—TF

TF
- GATA1 → avvicina LCR al promotore di γ → stimola la prod dell’emoglobina fetale
- BCL11A → impedisce a LCR di avvicinarsi al promotore di γ → LCR è cstretto ad attivare la trascr di β

Question 29

Come vengono affrontate le emoglobinopatie?

Answer 29

Sono causate da una mutazione del gene β
Si può ridurre la gravità del fenotipo mantenedo alti I liv di emoglobina γ

Metodi per aumentare l’espressione dellα globina γ
- Manipolazione genica → con una prot chimerica si cerca di ripristinare il loop e produrre la globina γ
- Trattamento farmacologico → si inibisce G9A (l’enzima che metila H3K9)
- K-o di BCL11A

Question 30

Cosa sono gli insulators?

Answer 30

Sono barriere presenti nel genoma che impediscono la formazione dei loop
Sono sequenze che che fungono da sito per i CTCF

Question 31

Quali funzioni hanno gli insulators?

Answer 31

• Bloccare l’autopropagazione dell’eterocromatina
• Definire i range di attività degli enhancer

Question 32

Cosa sono i TADs?

Answer 32

Sono regioni di DNA delimitate da due insulators
Hanno confini molto conservati → anomalie dei confini determinano cambiamenti nelle coppie promotore—enhacer

Question 33

Cosa può o non può succedere all’interno di uno stesso TAD?

Answer 33

• Le seq di uno stesso TAD posso interagire fra loro ma non con quelle di un altro TAD
• Lo status epigenetico è uniforme → tutto il TAD è eucromatina o eterocromatina
• In uno stesso TAD possono esserci loop sia costitutivi che inducibili

Question 34

Quali mutazioni possono avvenire ai confini dei TAD?

Answer 34

• Delezione di un confine → si crea un unico TAD
• Inversione di due confini → possibile errore nella lettura dei promotori
• Duplicazione → formazione di un nuovo TAD

Question 35

Cosa sono i compartimenti cromosomici?

Answer 35

Sono gruppi di TADs con modifiche epigenetiche simili tra loro

Question 36

Cosa sono i territori cromosomici?

Answer 36

Sono una correlazione tra attività e posizione nel nucleo di un gene
- Periferia → geni inattivi → eterocromatina
- Centro → geni attivi → eucromatina