4. Tecniche di laboratorio Flashcards
Cosa sono i vettori?
Sono sequenze di DNA di varie dimensioni in cui viene inserita una seq d’interesse
Cosa sono i plasmidi?
Sono molecole circolari di DNA a doppio filamento che possono essere replicati solo se presentano al loro interno un origine di replicazione
Come si inseriscono i plasmidi nei batteri?
(3 modi)
- Trasformazione batterica orizzontale → avviene solo in condizione di stress
- Coniugazione batterica → il plasmide deve avere la seq per il pilo
- Trasduzione → viene infettato il batterio
Cos’è la competenza?
È la capacità del batterio di aumentare la permeabilità della membrana in modo da riuscire a fare l’uptake del plasmide
Come si può indurre la competenza in batterio?
- Trasfomazione chimica
1) Batteri resi competenti chimicamente
2) Solz batteri+plaside in ghiaccio 30 min
3) Shock termico (37°) per qualche sec - Elettroporazione
1) Batteri resi competenti elettrochimicamente
2) Solz batteri+plasmide in ghiaccio
3) Solz sottoposta a un ce ← senza ghiaccio
→ il ce crea dei pori sulla membrana
4) Solz rimessa in ghiaccio + nutrienti
Come si separano i batteri trasformati dai non trasformati?
Il plasmide deve contenere il gene per la resistenza ad un antibiotico
1)Si fanno crescere tutti i batteri
2)Si aggiunge l’antibiotico → i batteri che hanno fatto l’uptake sopravvivono
Per cosa è usata la trasformazione batterica?
Per amplificare la seq di interesse
Cos’è e come si fa la DNA preparation?
È la tecnica di estrazione del DNA dai batteri
1) Si centrifuga il brodo di batteri → si perde il liquido di nutrizione + si hanno solo i batteri
2) Si aggiunge SDS e NaOH
SDS degrada le membrane → fuoriuscita contenuto delle cellule
NaOH denatura il DNA → da dsDNA a ssDNA
3) Si neutralizza NaOH cn acetato di potassio → si riformano i lH fra i ssDNA
→ i plasmidi si rinaturano più facilmente mentre il cromosoma precpita
4) Filtraggio con una resina → trattiene DNA plasmidico + molec aspecifiche
5) Lavaggio + eluizione → si eliminano le molec aspecifiche + si ottiene DNA puro
Cosa sono e come funzionano gli enzimi di restrizione?
Sono endonucleasi usate da alcuni batteri per degradare il DNA fagico, non quello batterico perché è protetto da metilasi
Sono sito-specifiche → ricononscono i siti di restrizione
Possono operare 2 tipi di taglio:
- simmetrico → con estremità piatte
- asimmetrico → con estremità sticky
Lavorano a coppie di enzimi identici → ognuno taglia un filamento
Come si crea una nuova specie di DNA ricombinante?
- Provetta 1 → vettore + EdR = vettore tagliato
- Provetta 2 → inserto + EdR = inserto isolato
- Provetta 3 → vettore + inserto + DNA ligasi = DNA ricombinante
Come si può evitare, nella produzione del DNA ricombinante, che il vettore si richiuda senza l’inserto
- Usando 2 enzimi diversi → si creano estremità steacky non complementari
- Defosforilazione → delle estremità del vettore
Cos’è e come funziona il DNA cloning?
È l’amplificazione di una seq di DNA
1) Selezione + digestione dei plasmidi
2) Ottenimento DNA ricombinante
3) Insermento DNA nei batteri
4) Piastratura dei batteri
5) Verifica di chi ha fatto l’uptake
6) Prelievo + proliferazione colonia con l’uptake
7) Purificazione DNA
Cos’è il Multiple Cloning Site (MCS)
È una seq di DNA che si inserisce in un plasmide contenente tanti siti di restrizione che non sono presenti nel resto del plasmide
Permette di risolvere l’assenza naturale di siti nel vettore
Cos’è la gel elettroforesi?
È una tecnica usata per separare frammenti di DNA in base alle dimensioni
Descrivi l’attrezzatura usata per la gel elettroforesi
- Gel → polimero di poliammide o agarosio
- Vaschetta → presenta il gel con dei pozzetti al centro e alle estremità due elettrodi
- Lastra fotografica → visibile la disposizione dei vari frammenti
Come funziona la gel elettroforesi
1) Viene trattato il DNA col glicerolo
2) Il DNA viene versato nei pozzetti
3) Campo elettrico tira il DNA → le molec più piccole passano più facilmente
4) Gel inserito in bromuro di etidio + stimolato con UV → emissione segnale fluorescente fissato su una lastra fotografica
Descrivi il procedimento per inserire un pezzo di vettore in un altro vettore che ha come intermedio la gel elettroforesi
- Provetta 1 → plasmide A + 2 Edr
- Provetta 2 → plasmide B (con l’inserto) + Edr1) Taglio dei plasmidi
2) Plasmide aperto + sequenza nei pozzetti → 1 pozzetto per provetta
3) Gel elettroforesi
4) Taglio del gel → si preleva vettore A + inserto B
5) DNA ligation
Cosa sono le DNA libraries?
Sono collezioni di frammenti di DNA clonati in vettori che vengono usati per effettuare screening
Ne esistono di 2 tipi: genomic e cDNA libraries
Come si crea una genomic libraries?
Viene usato tutto il genoma del soggetto
1) Taglio del DNA con EdR
2) Gel elettroforesi → selezione dei frammenti desiderati
3) Clonaggio dei frammenti
4) Vettori trasformati in batteri → replicazione
Cos’è la rappresentatività?
È la misura di quanto una library è utile, ovvero quanto genoma è rappresentato
Non è mai il 100%
Come si crea una cDNA library
1) Si isola l’mRNA dagli altri RNA
2) Retrotrascrizione + sintesi 2° filamento
3) Clonazione cDNA
4) Inserimento linker (= seq con i SdR)
5) Clonaggio in un vettore
6) Trasformazione del plasmide nei batteri
Cos’è e come si fa un library screening?
È un modo per identificare le seq nella libraries
3 modi:
a. in base alla seq di nt
b. in base alla seq di aa
c. in base alla f.ne
Cos’è un probe?
È una seq di DNA almeno parzialmente complementare a quella di interesse
Permette di visualizzare la seq d’interesse
Possono essere sia a DNA che a RNA
Come funziona lo screening per ibridazione?
1) Denaturazione DNA a doppio filamento → aumento T/aggiunta NaOH
2) Aggiunta di probe
3) Rinaturazione → calo T/tamponamento basicità
4) Visualizzazione probe → si usa un probe con 32P (= P radioattivo) o legato a epitopi (antigeni)
Quali sono i fattori che modulano l’ibridazione?
- Temperatura → n° lH rotti ∝ T
- Ambiente chimico → aumenta la precisione di appaiamento, si aggiunge NaOH
- Lunghezza delle seq → difficoltà di rinaturazione ∝ lunghezza seq
Come si crea un probe a RNA?
1) In una provetta plasmide + RNApol (T7’s) + nts marcati
2) Linearizzazione del plasmide con EdR
3) T7’s pol trascrive il plasmide → si ottiene il probe a RNA
Come si crea un probe a DNA?
1) Denaturazione del filamento stampo
2) Rinaturazione del filamento con primers (= seq da 6 nt)
3) Aggiunta di DNApol + dNTPs marcati
4) Allungamento dei primers
5) Selezione dei probe > 500-1000 bp
Quali sono le tecniche di hybridation screening?
(solo i nomi e i substrati)
- Colony hybridation → DNA da colonie a filtro
- Southern blotting → DNA da gel di agarosio a filtro
- Northern blotting → RNA da gel di agarosio a filtro
- Western blotting → PROT da gel di agarosio a filtro
Come si fa una colony hybridation?
1) Si copre con un filtro la piastra contenente la library di batteri
→ alcuni batteri si appiccicano al filtro → distribuzione speculare
2) Filtro rimosso e trattato con SDS + NaOH
SDS → lisi batteri
NaOH → denaturazione DNA
3) Filtro + probes a contatto → ibridazione
4) Lastra fotografica sopra il filtro → viene impressionata dove i probes si sono legati
Com’è fatto un apparato da blotting?
Dal basso all’alto
- Buffer = solz tampone
- Vaschetta
- Filtro di carta
- Gel (dell’elettroforesi)
- Filtro di nitrocellulosa
- Fogli di carta assorbente
- Peso
Come si fa un southern blotting?
1) EdR digeriscono il DNA di varie cellule/tessuti
2) Gel elettroforesi dei frammenti
3) Gel posto nell’aparrato da blot → passaggio frammenti gel→filtro
4) Ibridazione del filtro con probes radioattivi
5) Sviluppo della lastra fotografica
Come si fa un northern blotting?
1) In ogni pozzetto si mette l’RNA proveniente da un tessuto ≠
2) Gel elettroforesi
3) Gel nell’apparato di blot
4) Ibridazione coi probes → si hanno bande ± spesse → spessore ∝ espressione dei probes
Qual è lo scopo e come si fa un functional screening?
Scopo: individuare la seq alla base di una certa f.ne
1) cDNA library inseriti in batteri
2) Prod mRNA dal plasmide
3) Estrazione mRNA + iniezione in embrioni di xenopus
Se lo xenopus esprime la f.ne il gene è stato trovato
Cos’è la PCR?
È un processo usato per amplificare una sequenza di DNA, a partire da un ssDNA, sfruttando dei cicli di riscaldamento/raffreddamento
Quali sono i componenti nel mix di reazione di una PCR?
(6)
- DNA stampo
- Inneschi
- Taq polimerasi = pol dei batteri termofili
- dNTPs
- Soluzione tampone
- Termociclatore
Quali sono le fasi della PCR?
1) Melting → T a 95°, denaturazione dsDNA
2) Annealing → T a 50-70°, i primer legano le seq
3) Allungamento → DNA pol allunga i primers
Le fasi si ripetono almeno 3 volte
Quali sono le applicazioni della PCR?
- Amplificazione di un gene d’interesse → si sfrutta un primer con una codina sporgente (= SdR)
- Diagnosticare malattie rare
- Medicina forense
- Studi di gene expression → RT-PCR + qPCR
- Produzione di proteine ricombinanti
Cos’è la retrotrascriptase-PCR (RT-PCR)?
= tecnica per misurare il livello di espressione di un gene che sfrutta il cDNA
Ha 4 fasi:
1. Purificazione dell’mRNA
2. Retrotrascrizione dell’mRNA in cDNA
3. cDNA come template per la PCR
4. Analisi del prodotto di PCR su gel di agarosio
Il numero iniziale di copie di cDNA si può solamente stimare all’inizio della fase esponenziale (Ct)
Cos’è la real-time PCR?
= PCR in grado di monitotare la quantità di DNA ad ogni cilco
Si usa il SYBR green → emette fluorescenza quando lega il DNA
→ fluorescenza ∝ quantità di dsDNA
Cosa può causare una GOF?
- Mutazione
- Sovraespressione
Cosa può causare una LOF?
- Knock-out (= eliminazione del gene)
- Knock-down (=silenziamento del gene)
- Anticorpi neutralizzanti
- Proteine dominant negative
Come possono essere i processi GOF e LOF?
- Transienti
- Stabili
Quali sono le strategie per introdurre acidi nucleici in una cellula eucariota?
(solo i nomi delle tecniche)
- Trasfezione
- Microiniezione
- Elettroporazione
- Trasduzione
Come funziona la trasfezione?
Si legano dei carriers agli acidi nucleici → si neutralizza la carica – e possono passare la membrana
2 modalità di ingresso usando liposomi anionici come carriers:
a. Endocitosi
b. Fusione
Quali sono i principali carriers che agiscono nella trasfezione?
- Sali di calcio fosfato → funzionano su tutte le cellule
- Lipidi cationici → come liposomi
- Lipidi anionici → come liposomi
Quali sono pro/contro della microiniezione?
Pro → Si inietta qualsiasi molec in quantità e locazione precise
Contro → si danneggia la membrana
Come funziona l’elettroporazione?
Come per i batteri ma è molto dannosa per le cellule
Come funziona la trasduzione?
Acidi nucleici inseriti tramite:
- Vettori virali → plasmide ± integrato nel genoma
- Retrovirus → integrazione cn modifica stabile del genoma
Come può avvenire l’integrazione del DNA?
- Integrazione random
- Ricombinazione omologa
Come si distinguono le cellule che hanno fatto ricombinazione omologa da quelle con l’integrazione casuale?
Con una selezione positiva e negativa → si inserisce nel DNA un gene per la selezione positiva (+) e uno per la selezione negativa (-)
I geni + e – si dispongono in maniera ≠ rispetto a delle seq ad alta omolologia (SO) nelle due integrazioni:
- Ricombinazione omologa → SO— + — SO — -
- Integrazione casuale → SO — + — - —SO
1) Selezione positiva → sopravvivono tutte le cell col gene + tra le due SO
→ si eliminano le cellule non integrate
2) Selezione negativa → sopravvivono tutte le cell che non hanno il gene – tra le SO
→ si eliminano le c con l’integrazione casuale
Cos’è il gene targeting?
È una tecnica che permette di inserire seq in locus specifici usando la ricombinazione omologa
Cosa sono gli animali transgenici?
Sono animali il cui genoma è stato modificato stabilmente al fine di ottenere una GOF/LOF di una sequenza
Come si creano i topi transgenici?
(cosa si usa e che meccanismo si applica)
Si usa un dna ricombinante contenente:
- Promoter
- Enhancer
- Gene di interesse o codificante per la prot reporter
- Introne
- Seq per la poliadenilazione
1) Inserimento del DNA linearizzato in un pronucleo maschile di un oocita fecondato
2) L’embrione viene impiantato in una semi-pregnant foster mother
3) Alla nascita si verifica se il topo e transgenico con PCR + southern blotting di cellule di coda
4) I topi poi possono essere incrociati per ottenere omo/eterozigti
Quali sono le variabili che alterano l’espressione di un gene
Tipo di promotore → costitutivo, inducibile, ubiquitario, tessuto specifico, endogeno, esogeno
- Sito di integrazione → In una regione inattiva il gene non viene espresso, vicino a un promotore endogeno l’espressione dipende dal promotore del gene endogeno
- Riconoscimento da parte della cellula ospite→ se l’inserto viene riconosciuto come estraneo viene sottoposto a metilazione
-Positioning effect → può alterare l’espressione di altri geni
Come si crea un topo Knock-out?
1) Si isola la cellula con la sequenza di interesse
2) Si inseriscono i geni per resistenza alla neomicina + timidina chinasi
3) Si fa elettroporazione di cellule ES + costrutto di gene targeting
4) Selezione positiva e negativa per scartare le cellule con integrazione casuale
5) Si fanno crescere le colonie che poi avranno tre destini diversi: PCR, Southern blotting, restare in coltura
Le prime due tecniche permettono di capire se il gene è stato integrato correttamente
6) ES iniettate in blastocisti → blastocisti impiantata in una foster mother → gravidanza
7) Si incrociano topi chimeraXomozigoti recessivi + chimeraXchimera → si ottengono k-o omozigoti
Cos’è il cross breeding nei topi?
È il grado di penetranza delle cellule ES iniettate che si stima in base alla gradazione del manto del topo (nero = ES non modificate, marrone = ES modificate)
Per avere la certezza che il topo sia effettivamente k-o si incrociano più volte i topi marroni perché solo il manto potrebbe derivare dalle cellule ES
Cos’è il k-o conizionale?
È una procedura che permette di inattivare un gene in tessuti e momenti precisi
Come si fa un k-o condizionale tessuto specifico?
a. Prod topo A transgenico contenente una Cre ricombinasi
b. Prod topo B con dei siti loxP che hanno la stessa ddirezione dell’esone da silenziare
c. Incrocio topi AxB → topo con siti loxP + esone compreso rimosso nei tessuti in cui è espressa la Cre ricombinasi
Cos’è la Cre ricombinasi?
È un complesso enzimatico che causa la ricombinazione omologa tra i due loxP
Che cosa sono i siti lox P?
Sono delle seq di DNA caratterizzate da una direzionalità precisa rispetto all’esone e che danno esiti diversi sotto l’azione della Cre:
- Stessa direz → si ottiene: seq con 1 loxP e senza esone + episoma con esone + 1loxP
- Direz opposta → si ottiene la seq con 2 loxP che coontengono l’esone invertito dalla Cre
Come funziona il k-o condizionale con l‘inducible gene targeting?
(controllo temporale)
Si usa una Cre-ER controllata da un promotore inducibile → la Cre agisce solo se attivata dagli estrogeni
Come si può avere un k-o condizionale sotto un controllo spaziale e temporale?
Si usa una Cre-ER controllata da un promotore tessuto-specifico
A cosa servono i topi knock-in?
Per studiare se la GOF di un certo gene può provocare lo sviluppo di un tumore
Come si iperattiva un gene per creare un topo k-i?
Seq esogena composta da: gene1 — gene 2 — cassetta LSL — gene3 mutato — altre seq
Cassetta LSL (= lox-stop-lox) impedisce la trascrizione della seq esogena
Attivando la Cre viene eliminata la cassetta LSL → trascrizione cromosoma + seq esogena
Come si riparano i DBS (= double strand break)
- NHEJ (rapido + poco preciso)
Si usano enzimi che catalizzano indels - HDR (lento + preciso)
Richiede l’uso di un template e viene usato per introdurre mutazioni/seq desiderate
Cos’è CRISPR/CAS?
È un meccanismo immunitario usato naturalmente da alcuni batteri e che viene usato in laboratorio come tecnica di genome editing
I batteri lo usano per degradare, tagliando, il DNA/RNA di un virus
Cos’è un CRISPR array?
È un cluster formato da CRISPR (= seq ripetute e conservate) + spacer (= seq non ripetute e non conservate)
Cosa sono le CAS?
Sono delle seq che affiancano i CRISPR array e codificano per enzimi di modifica+metabolismo del DNA
Come funziona CRISPR/CAS nei batteri?
(fasi, funzionamento generale, funzionamento specifico)
4 fasi:
a. Infezione fagica
b. Acquisizione degli spacers
c. Biogenesi + processamento crRNA
d. Degradazione DNA target
Funzionamento generale
1) CRISPR array trascritto come unico filamento
2) Frammentazione RNA
3) Il frammento di RNA fa da guida per la degradazione del DNA bersaglio
Funzionamento specifico (cambia in base alla famiglia di CRISPR)
- Tipo I
1) Trascr del DNA → il crRNA forma degli hairpin in corrispondenza dei CRISPR
2) crRNA tagliato → si ottiene il gRNA
3) gRNA guida Cas3 sul DNA fagico → degradazione DNA
- Tipo II
1) crRNA resta lineare → a liv dei CRISPR si associa al trascrRNA
2) trascrRNA richiama RNAsi endogena → taglio del crRNA per ottenere gRNA
3) gRNA guida Cas9 al DNA per degradarlo
- Tipo III
1) crRNA crea delle anse (≠ hairpin) a liv dei CRISPR
2) crRNA tagliato a livello dei CRISPR → si ottiene gRNA
3) gRNA guida una Cas (= complesso multiprot) alla degradazione del DNA fagico
Cos’è la sequenza PAM?
È una seq di 3 nt (XGG) posta all’estremità 3’ del DNA bersaglio
Riesce ad attivare Cas9 → Cas9 si attva solo se PAM è subito a valle della seq d’interesse
Descrivi Cas9
È un enzima composto da 2 domini nucleasici che degrada il DNA che riconosce come “patogenico”
Esistono varie classi di Cas9
Agisce in maniera sito-specifica grazie a:
- 20nt nel gRNA che fungono da guida appaiandosi al DNA esogeno
- PAM site a valle della seq target
Per cosa si usa il sistema CRISPR/CAS in laboratorio?
Si sopprime l’espressione di un gene tagliando il DNA con una Cas, per poi riparare il taglio con NHEJ o HDR
Applicazioni:
- Libraries di gRNA
- Creare modelli per lo studio di malattie poligeniche
