4. Tecniche di laboratorio Flashcards
Cosa sono i vettori?
Sono sequenze di DNA di varie dimensioni in cui viene inserita una seq d’interesse
Cosa sono i plasmidi?
Sono molecole circolari di DNA a doppio filamento che possono essere replicati solo se presentano al loro interno un origine di replicazione
Come si inseriscono i plasmidi nei batteri?
(3 modi)
- Trasformazione batterica orizzontale → avviene solo in condizione di stress
- Coniugazione batterica → il plasmide deve avere la seq per il pilo
- Trasduzione → viene infettato il batterio
Cos’è la competenza?
È la capacità del batterio di aumentare la permeabilità della membrana in modo da riuscire a fare l’uptake del plasmide
Come si può indurre la competenza in batterio?
- Trasfomazione chimica
1) Batteri resi competenti chimicamente
2) Solz batteri+plaside in ghiaccio 30 min
3) Shock termico (37°) per qualche sec - Elettroporazione
1) Batteri resi competenti elettrochimicamente
2) Solz batteri+plasmide in ghiaccio
3) Solz sottoposta a un ce ← senza ghiaccio
→ il ce crea dei pori sulla membrana
4) Solz rimessa in ghiaccio + nutrienti
Come si separano i batteri trasformati dai non trasformati?
Il plasmide deve contenere il gene per la resistenza ad un antibiotico
1)Si fanno crescere tutti i batteri
2)Si aggiunge l’antibiotico → i batteri che hanno fatto l’uptake sopravvivono
Per cosa è usata la trasformazione batterica?
Per amplificare la seq di interesse
Cos’è e come si fa la DNA preparation?
È la tecnica di estrazione del DNA dai batteri
1) Si centrifuga il brodo di batteri → si perde il liquido di nutrizione + si hanno solo i batteri
2) Si aggiunge SDS e NaOH
SDS degrada le membrane → fuoriuscita contenuto delle cellule
NaOH denatura il DNA → da dsDNA a ssDNA
3) Si neutralizza NaOH cn acetato di potassio → si riformano i lH fra i ssDNA
→ i plasmidi si rinaturano più facilmente mentre il cromosoma precpita
4) Filtraggio con una resina → trattiene DNA plasmidico + molec aspecifiche
5) Lavaggio + eluizione → si eliminano le molec aspecifiche + si ottiene DNA puro
Cosa sono e come funzionano gli enzimi di restrizione?
Sono endonucleasi usate da alcuni batteri per degradare il DNA fagico, non quello batterico perché è protetto da metilasi
Sono sito-specifiche → ricononscono i siti di restrizione
Possono operare 2 tipi di taglio:
- simmetrico → con estremità piatte
- asimmetrico → con estremità sticky
Lavorano a coppie di enzimi identici → ognuno taglia un filamento
Come si crea una nuova specie di DNA ricombinante?
- Provetta 1 → vettore + EdR = vettore tagliato
- Provetta 2 → inserto + EdR = inserto isolato
- Provetta 3 → vettore + inserto + DNA ligasi = DNA ricombinante
Come si può evitare, nella produzione del DNA ricombinante, che il vettore si richiuda senza l’inserto
- Usando 2 enzimi diversi → si creano estremità steacky non complementari
- Defosforilazione → delle estremità del vettore
Cos’è e come funziona il DNA cloning?
È l’amplificazione di una seq di DNA
1) Selezione + digestione dei plasmidi
2) Ottenimento DNA ricombinante
3) Insermento DNA nei batteri
4) Piastratura dei batteri
5) Verifica di chi ha fatto l’uptake
6) Prelievo + proliferazione colonia con l’uptake
7) Purificazione DNA
Cos’è il Multiple Cloning Site (MCS)
È una seq di DNA che si inserisce in un plasmide contenente tanti siti di restrizione che non sono presenti nel resto del plasmide
Permette di risolvere l’assenza naturale di siti nel vettore
Cos’è la gel elettroforesi?
È una tecnica usata per separare frammenti di DNA in base alle dimensioni
Descrivi l’attrezzatura usata per la gel elettroforesi
- Gel → polimero di poliammide o agarosio
- Vaschetta → presenta il gel con dei pozzetti al centro e alle estremità due elettrodi
- Lastra fotografica → visibile la disposizione dei vari frammenti
Come funziona la gel elettroforesi
1) Viene trattato il DNA col glicerolo
2) Il DNA viene versato nei pozzetti
3) Campo elettrico tira il DNA → le molec più piccole passano più facilmente
4) Gel inserito in bromuro di etidio + stimolato con UV → emissione segnale fluorescente fissato su una lastra fotografica
Descrivi il procedimento per inserire un pezzo di vettore in un altro vettore che ha come intermedio la gel elettroforesi
- Provetta 1 → plasmide A + 2 Edr
- Provetta 2 → plasmide B (con l’inserto) + Edr1) Taglio dei plasmidi
2) Plasmide aperto + sequenza nei pozzetti → 1 pozzetto per provetta
3) Gel elettroforesi
4) Taglio del gel → si preleva vettore A + inserto B
5) DNA ligation
Cosa sono le DNA libraries?
Sono collezioni di frammenti di DNA clonati in vettori che vengono usati per effettuare screening
Ne esistono di 2 tipi: genomic e cDNA libraries
Come si crea una genomic libraries?
Viene usato tutto il genoma del soggetto
1) Taglio del DNA con EdR
2) Gel elettroforesi → selezione dei frammenti desiderati
3) Clonaggio dei frammenti
4) Vettori trasformati in batteri → replicazione
Cos’è la rappresentatività?
È la misura di quanto una library è utile, ovvero quanto genoma è rappresentato
Non è mai il 100%
Come si crea una cDNA library
1) Si isola l’mRNA dagli altri RNA
2) Retrotrascrizione + sintesi 2° filamento
3) Clonazione cDNA
4) Inserimento linker (= seq con i SdR)
5) Clonaggio in un vettore
6) Trasformazione del plasmide nei batteri
Cos’è e come si fa un library screening?
È un modo per identificare le seq nella libraries
3 modi:
a. in base alla seq di nt
b. in base alla seq di aa
c. in base alla f.ne
Cos’è un probe?
È una seq di DNA almeno parzialmente complementare a quella di interesse
Permette di visualizzare la seq d’interesse
Possono essere sia a DNA che a RNA
Come funziona lo screening per ibridazione?
1) Denaturazione DNA a doppio filamento → aumento T/aggiunta NaOH
2) Aggiunta di probe
3) Rinaturazione → calo T/tamponamento basicità
4) Visualizzazione probe → si usa un probe con 32P (= P radioattivo) o legato a epitopi (antigeni)
Quali sono i fattori che modulano l’ibridazione?
- Temperatura → n° lH rotti ∝ T
- Ambiente chimico → aumenta la precisione di appaiamento, si aggiunge NaOH
- Lunghezza delle seq → difficoltà di rinaturazione ∝ lunghezza seq
Come si crea un probe a RNA?
1) In una provetta plasmide + RNApol (T7’s) + nts marcati
2) Linearizzazione del plasmide con EdR
3) T7’s pol trascrive il plasmide → si ottiene il probe a RNA
Come si crea un probe a DNA?
1) Denaturazione del filamento stampo
2) Rinaturazione del filamento con primers (= seq da 6 nt)
3) Aggiunta di DNApol + dNTPs marcati
4) Allungamento dei primers
5) Selezione dei probe > 500-1000 bp
Quali sono le tecniche di hybridation screening?
(solo i nomi e i substrati)
- Colony hybridation → DNA da colonie a filtro
- Southern blotting → DNA da gel di agarosio a filtro
- Northern blotting → RNA da gel di agarosio a filtro
- Western blotting → PROT da gel di agarosio a filtro
