3. Trascrizione eucarioti Flashcards by Agnese Avezzù

Composizione del complesso di inizio

PIC

= RNA pol + TF basali

È necessario ma non sufficiente all’inizio della trascr

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Quali sono i due tipi di fattori di trascrizione

Basali → permettono la formazione del PIC

- Regolatori → attivano la tracr solo se c’è un PIC già formato

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Composizione del promotore

= enhancer + core promoter + transcription star site (+1)

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Per quali RNA codificano le RNA pol eucariotiche?

I → precursori dell’rRNA (28 + 18 + 5.8 S)
II → m + sn + sno + mi + lnc RNA
III → tRNA + 5S RNA + U6 RNA (= sn rna)

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Da cosa è caratterizzata la RNA pol II rispetto alle altre?

CDT = coda in C-term, composta di 7aa ripetuti 52 vv

Seq eptamerica =Y S2 P T S5 P S7 → le S2/5 fosforilate sono riconosciute dalle CDK

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Trascrizione negli eucarioti (in generale)

Inizio, TBP, allungamento, terminazione

Inizio
Le varie pol vengono reclutate dai TF (senza TF la pol non può legare il DNA) hanno ognuna un proprio promotore
TBP = TATA binding protein, il suo dominio N-term è di transattivazione di altri TF

Allungamento
Prod inizi abortivi
Lunghezza trascritto variabile in alla pol → I lungo, II variabile ∝ n° introni, III corto

Terminazione
Pol I+II → prot transattive +stretch destabilizzanti + endo+esonucleasi
Pol III → è la pol stessa il fattore trans attivo

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RNA pol I

trascritto e TF

Trascritto
Pre rRNA 45S → e il precursore dei vari rRNA ed è trascritto da geni ripetuti in tandem

TF
UBF + SL1 + TBP

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Maturazione pre-rRNA

Per ottenere i vari rRNA il pre-rRNA viene tagliato e accorciato
L’esnucleasi che accorcia ha la f.ne limitata da metilazione di alcune basi e struttura secondaria dell’RNA

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RNA pol I

inizio trascrizione

1) 2UBF legano l’UPE
2) UBF piega il DNA → UPE vicino al promotore
3) Vengono reclutati (un tf recluta il successivo) SL1 + TBP + pol I

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RNA pol I

terminazione della trascrizione

Reb1 = terminatore
Rnt1 = endonucleasi
Rat1 =esonucleasi

A 100bp ca dalla fine del trascritto → a valle ci sono elem cis/trans attivi che impediscono l’apertura di una nuova bolla

1) Reb1 si siede sul sito di terminazione bloccando la pol
Il sito è a valle di una seq ricca di T → l pol-DNA instabile
2) Rnt1 taglia a liv di una forcina
3) Rat degrada la forcina verso la pol (5’→3’) inducendo il distacco definitivo della pol

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RNA pol II

promotori e TF

Promotori (2 tipi)
TATA+ → ha la TATA box
TATA- → non ha la TATA box, ma ha le seq DPE+Inr o le isole CpG
TATA e DPE servono ad ancorare i TF

TF
tata+ → TBP + TF2 D+A+B+F+E+H
TF2H che ha la CDK che riconosce la coda della pol
tata- → TBP + TF2D

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RNA pol II

formazione del PIC

TATA+
1) TF2D lega il promotore
2) TATA permette apertura filam → TBP lega il DNA
3) a monte della TATA si legano TF2 A+B+F+E+H
TATA-
a. Inr + DPE
1) TBP non lega direttamente il DNA → TBP — TAF (250+150) — DNA
2) Formazione completa di TF2D
3) Aggiunta sequenziale di TF2A+B+F+E+H
b. Isole CpG
1) SP1 lega le isole
2) Legame indiretto TBP — TAF (250+150) — SP1 — DNA
3) Aggiunta sequenziale di TF2 D (il restante)+A+B+F+E+H

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RNA pol II

inizio della trascrizone

1) Reclutamento pol II
2) CDK7 fosforila ser5
3) Richiamati fattori di capping + NELFs/DSIF
4) Pausa a +20/+30 (grazie a NELFs)
5) Capping

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RNA pol II

allungamento

Ha velocità variabile e richiede una topoisomerasi per allentare il superavvolgimento del DNA

1) PTEFb viene reclutata
2) CDK9 fosforila ser2 + NELFs (quest’ultimi vengono allontanati)
3) Splicing co+post trascrizionali

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RNA pol II

terminazione della trascrizione

1) Defosforilazione ser5
2) Trascr seq AAUAAA ≡ seq cis di terminazione
3) CPS (= fattore normalmente legato alla coda della pol) si stacca + lega la seq AAUAAA
4) CPS recluta endo+esonucleasi → taglio mRNA + degradazione moncone

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Meccanismi di maturazione dell’mRNA

solo elenco

Capping
Splicing
Poliadenilazione

Capping

meccanismo, enzimi e funzioni

Meccanismo che crea un l atipico 5’-5’ tra l’ultimo in 5’ sull’mRNA e un GMP
CBP (=capping binding protein) legano il nt in 5’ ← protezione dalle endonucleasi
Le CBP legano i fattori di splicing
→ insieme possono:
~ reclutare TREX (complesso che porta l’mRNA fuori dal nucleo)
~ legare eIF4 (fattore di inizio trad)

Enzimi coinvolti:

RNA trifosfatasi → rimuove il P in γ del nt in 5’
Guanil transferasi → legame 5’-5’
Metil transferasi → aggiunta CH3 a G

Funzioni:

Garantire il corretto splicing del 1° introne
Facilitare trasporto nel citosolo + traduzione

Splicing

meccanismo

Richiede capping + Pser5

1) Spliceosoma riconosce GU in 5’ → taglio a monte di GU
2) Formazione del lariat con il branch site
3) Attacco OH in 3’ dell’esone a monte sul P in 5’ dell’esone a valle
4) Liberazione introne + unione dei due esoni

Poliadenilazione

Non avviene in tutti gli mRNA
Avviene dopo la terminazione

1) PoliA polimerasi aggiunge 10A all’estremità 3’
2) Ai 10° si associano le poliA binding prot → aggiunti altri 200 A
I 200 A permettono l’interazione con il cap + prot di capping+splicing

Cos’è e che f.ni ha l’exon junction complex (EJC)

= insieme delle prot presenti alle estremità dei due esoni → quando si uniscono formano l’EJC

È coinvolto nell’esportazione dell’mRNA nel citosol

I ribosomi lo staccano dall’mRNA durante la trad
Se resta a lungo sul l’mRNA (= i ribosomi sistaccano in anticipo) richiama gli enzimi della non sense decay → degradazione mRNA

RNA pol III

Promotori, TF

Promotori (3 tipi)
Cambiano in base al trascritto da produrre
- Promotore interno alla seq codificante → per rRNA 5S + tRNA
- Upstream promoter → snRNA U6

TF
Sono sepecifici del trascritto da produrre
  - rRNA 5S → TF3 A+C+B 
  - tRNA → TF3 C+B 
  - snRNA U6 → SNAPc + simil TF3B
!! TBP è una subunità di TF3B

RNA pol III

inizio della trascrizione

rRNA
1) TF3A lega la box A
2) TF3C lega la box C + recluta TF3B
3) TBP in TF3B posiziona la pol
tRNA
1) TF3C recluta TF3B
2) TBP in TF3B posiziona la pol
snRNA
1) SNAPc lega la seq PSE + recluta TF3B
2) TBP in TF3B posiziona la pol

RNA pol III

terminazione della trascrizione

Richiede un tratto di poliU sull’RNA (≡ tratto di poliT sul DNA) ← rallenta la trascr ( ci sono pochi UTP)

Si usa la subunità C37 della pol 3

1) C37 lega la 5° T esposta → modifica del complesso
2) Riduzione stabilità del complesso → distacco

Maturazione dei tRNA

1) Formazione struttura 2° autonoma
2) RNAsi tagia la seq in 5’ non appaiata
3) Esonucleasi digeriscono il 3’ fino alla seq CCA
4) Se c’è un introne viene eseguito lo splicing

Come si formano i ribosomi?

6-step process 1) Sintesi rRNA +prot ribosomiali (RPs) + fattori di assemblaggio (Afs) 2) Cleavage pre-rRNA 3) Modifiche di rRNA + RPs + Afs 4) Assemblaggio coadiuvato dai Afs 5) Esportazione del ribosoma nel citosol 6) Controllo + eliminazione ribosomi fallaci

Meccanismo di amminoacilazione del tRNA

1) Amminoacil-tRNA sintetasi preparano un legame ad alta energia 2) COOH dell’aa dà attacco nuclefilo al Pα di un ATP → rottura l. Pα—Pβ 3) OH in 3’ del tRNA dà attacco al COOH dell’aa adenilato

Cos’è il wobbling?

Meccanismo attuato dalla cellula in cui i 3° nt di mRNA e tRNA possono non appaiarsi perfettamente in modo canonico, mentre i primi 2+2 si Permettere alla cellula di salvarsi da mutazioni del 3° nt

Quali sono le caratteristiche della trascrizione genica?

È combinatoriale → esistono varie combinazioni on/off È cooperativa → la forza di l TF—DNA ∝ n° TF coinvolti in quel promotore/enhancer È sinergistica → più Tf aumentano la v di trascrizione (1+1=11)

Cosa sono e come funzionano gli insulators?

Sono seq poste tra enhancer e promotore (del gene X) Bloccano l’attività dell’enhancer sul promotore di X che pero può agire sul promotore di Y che sta a monte Bloccano l’eterocromatizzazione di una parte del cromosoma

Descrivi la struttura dei TF

2 domini uniti dalla regione linker → DNA-biding + transattivazione - DNA-binding: lega il response element sul DNA e determina la specificità del TF per quella seq - Transattivazione: comunica con apparato di trascrizione, modellatori della cromatina e cofattori

Caratteristiche di recettori degli ormoni steroidei

Sono presenti sia nel nucleo che nel citosol Hanno un’attività regolata a feedback negativo Offrono una risposta bifasica: - Primaria → trascr degli early genes -Secondaria → indotta dai TF prdotti dagli early genes

Come funzionano i recettori per gli ormoni steroidei?

Meccanismo dei recettori citosolici In assenza di ligando sono associati a HSPs 1) L’ormone attraversa la membrana e lega il recettore 2) Cambio conformazione del recettore → si stacca alle HSPs + dimerizza 3) Dimero entra nel nucleo per legare ERE (estrogen element response) → trascr ON Meccanismo dei recettori nucleari In assenza di ligando lega un co-repressore + recluta delle deacetilasi per compattare la cromatina 1) L’ormone lega il recettore → cambio conformazione 2) Il recettore si stacca dal co-repressore + lega un co-attivatore+acetilasi L’acetilasi permette il rilassamento della cromatina

Tipi di controllo della trascrizione ad opera dei TF

- Positivo → i TF legano dei co-attivatori - Positivo e negativo → prot architettoniche forniscono la giusta geometria per l’interazione tra due TF - Negativo → si usano dei repressori con vari meccanismi a. nel citosol il repressore lega l’attivatore che non può più entrare nel nucleo b. il repressore è legato al silencer e interagisce col PIC c. enhancer con 2 response element distinti (uno per il repressore e uno per l’attivatore) → se R e A sono entrambi presenti prevale R d. enhancer con 2 response element parzialmente sovrapposti → A e R sono in competizione tra loro e. HDAC = complesso proteico che promuove il compattamento della cromatina

Come sono le modificazioni post traduzionali che regolano l'attivià dei TF?

- Fosforilazione → può essere sia inibitorio che attivatorio - Legame ad un attivatore - Rilascio dell’inibitore - Partner proteico - Taglio proteolitico - Cambio subunità - Sintesi proteica

Cos’è il promoter proxmal pausing?

Il blocco della pol a +20/+30 che permette il capping al 5’

Quali sono degli esempi di controllo della trascrizione | Sono riportati solo i “nomi” degli stress

- Ipossia | - Heat shock response