4 _ Fokkerij en transgene muizen Flashcards
Wat wordt bedoeld met een “inteeltstam”?
De individuen van een inteeltstam (ook: isogene stam) zijn genetisch uniform en missen
onderling genetische variatie.
Inteeltstam <=> minstens 98,6 % van de genen homozygoot
In praktijk <=> minstens 20 generaties broer x zuster paringen (of nakomeling x ouder)
Voordelen
- Genetische uniformiteit wordt verhoogd
- Reproduceerbaarheid van experimenten
Nadelen
- Minder vitaal (gevoelige voor infecties)
- Verminderde fokprestaties
- Meer onderhevig aan veranderingen in de omgeving
- Kostprijs
Wat is ‘genetic drift’? Hoe ontstaat het?
De genetische eigenschappen van een stam (inbred of outbred) kunnen na verloop van tijd wijzigen door
- Mutaties, contaminaties (andere stammen ingekruist) en (onbewuste) selectie
Genetic drift leidt tot het ontstaan van
- Substammen (inteeltstam)
- Subpopulaties (outbredstam)
Hoe kan genetic drift tegengegaan worden (inbred stam)?
Basiskolonie van waaruit productie fokkolonies worden opgestart
Nieuwe fokdieren in basiskolonie: enkel uit de hoofdlijn
Best geen twee op elkaar gelijkende inteeltstammen in eenzelfde ruimte huisvesten
Accuraat proefdierbeheer
Controle op genetische uniformiteit van inteeltstammen
- Alert zijn voor fenotypische afwijkingen
- Genetische monitoring
Hoe kan genetic drift tegengegaan worden (outbred stam)?
- Nieuwe fokdieren in de basiskolonie zetten : enkel uit de hoofdlijn
- Populatie moet voldoende groot zijn om inteelt te vermijden
- Monogame fok
- Slechts 1 pup per nest mag als fokdier worden ingezet
- Extremen worden niet gebruikt voor verdere fok
- 1 foundation colony ipv veel productiekolonies
- Rotatieschema
- Genetische monitoring
J / F
Om te vermijden dat de genetische eigenschappen van een inbredstam na verloop van tijd gaan wijzigen is het belangrijk om regelmatig dieren uit de productiekolonies terug naar de nucleus kweek te sturen.
Juist
J / F
“block mating” is een methode die wordt toegepast om bij outbredstammen behoud van genetische diversiteit te bevorderen
Juist
J / F
Proefdierkwekers zullen nieuwe ouderdieren van een rattenstam waar het gemiddeld aantal geboren pups 5 is maar waar er uitzonderlijk tot wel 12 pups/nest geboren worden, steevast kiezen uit de grootste nesten omdat op die manier de beste garantie onstaat dat de geselecteerde ouderdieren grote nesten gaan voortbrengen.
Fout
Wat wordt bedoeld met een knock-out dier?
Dier waarvan een gen uitgeschakeld is
Wat is een embryonale stamcel. Beschrijf een techniek van genetische manipulatie waarvoor embryonale stamcellen nodig zijn.
Embryonale stamcellen
- Oorspronkelijk geoogst uit binnenste van blastocyt
- Worden tegenwoordig als cellijnen in cultuur gehouden
- Zijn pluripotent (bezitten nog alle genetische eigenschappen en kunnen dan ook tot alle
weefseltypes ontwikkelen)
Homologe recombinatie
- ES cellen worden in medium gebracht met daarin de DNA constructen
- Poriën ter hoogte van de membraan van de EScel openen zich onder invloed van een electrische stroom
- Hierdoor gaan de gencontstructen de cel binnen (ELECTROPORATIE)
- In de celkern kunnen de constructen insereren in het genoom van de cel d.m.v. homologe recombinatie => het transgene DNA wordt op de gewenste plaats ingebracht
- De efficiënte van het proces van homologe recombinatie is laag (lukt slechts bij 1/106 cellen)
- Daarom wordt in het transgene DNA een ‘selectiegen’ ingebracht dat uitselecteren mogelijk maakt van de cellen waarbij de recombinatie gelukt is
- De gemuteerde ES-cellen worden in een blastocyst gebracht
- De gemuteerde ES-cellen en de cellen van de blastocyst vormen samen een embryo
- Het embryo wordt ingeplant in een schijnzwangere muis
- De nakomelingen zijn opgebouwd uit deels gemuteerde ES-cellen, en deels uit cellen van de blastocyst = chimeer
- Enkel als de geslachtscellen zijn gegroeid uit gemuteerde ES-cellen zullen de nakomelingen in staat zijn om de mutatie over te dragen naar de volgende generatie
Voordelen
- Mutatie niet willekeurig, maar gericht (Targeted Mutagenesis)
- Hierbij is zowel knock-out als knock-in mogelijk
Nadelen
- Momenteel enkel beschikbaar bij beperkt aantal diersoorten: waaronder weliswaar muis, rat (mens)
- Traag en duur proces
Beschrijf de techniek voor het genereren van transgene dieren via micro-injectie van constructen in een bevruchte eicel.
- Donor vrouwtje wordt behandeld met hormonen (PMSG/HCG) => SUPEROVULATIE
- Koppelen van gesuperovuleerd vrouwtje met fertiel mannetje leidt tot bevruchting
- Receptor vrouwtje wordt gekoppeld met een gevasectomeerd mannetje => schijnzwanger (pseudopregnancy)
- Donor vrouwtje wordt ge-euthanaseerd en uit de eileiders worden bevruchte eicellen verzameld
- Gemiddelde worden zo’n 100-200 eicellen bekomen uit 10-12 vrouwtjes
- Eicellen worden geïnjecteerd met oplossing van DNA constructen
- Via een operatie worden de gemanipuleerde eicellen ingeplant in de eileider van de schijnzwangere vrouwtjes (bevinden zich in hetzelfde stadium als de donorvrouwtjes)
- Van de 20 geïmplanteerde eicellen overleeft ongeveer 30 %
- 1 - 3 % van de nakomelingen is transgeen
- De receptor wordt geanestheseerd
- Via een flankincisie wordt de eileider opgezocht en naar buiten gebracht
- Met de ‘flushing needle’ worden de gemanipuleerde eicellen in het infundibulum gebracht
- Eileider wordt opnieuw in buik gebracht en wonde gesloten
Voordelen
- Relatief eenvoudig
- Relatief goedkoop
- Snelle techniek
- Geen ES-cellen nodig; deze techniek kan dus ook bij diersoorten waarvoor geen ES-cellen beschikbaar zijn
Nadelen
- Het DNA-construct integreert op een willekeurige plaats
- Het DNA-construct kan niet, 1 maar ook meerdere malen insereren
- Alle bekomen founders moeten gescreend worden, want kunnen allemaal van elkaar verschillen zowel qua genotype als qua fenotype
- Als het transgen integreert, nadat de eerste celdeling heeft plaatsgevonden, dan is er geen gegarandeerde germ-line transmission (mozaïek)
Geef 4 mogelijke oorzaken die aan de basis kunnen liggen van welzijnsproblemen bij transgene dieren.
Intentionele transgen gebonden problemen
- KO : wisselende effecten afhankelijk van de functie van het vernietigde gen
- Het transgen kan oorzaak zijn van productie van ‘vreemde’ eiwitten die niet thuishoren bij de diersoort, of in een bepaald weefsel : effect moeilijk in te schatten
- Bij multipele insertie van het transgen kan overexpressie van een bepaald eiwit, vb.
groeihormoon lijden tot metabole afwijkingen
Problemen tegenover het proces van modificeren
- Integratie van het transgen op een niet voorziene plaats (met insertionele mutagenese) => zowel anatomische (vb afwijkende ledematen) als neurologische afwijkingen mogelijk
- Fysische beschadigingen, vb aan het embryo tijdens de manipulatie
Problemen die typisch zijn voor de muizen die als donor gebruikt worden
Problemen tijdens de geboorte die soms nopen tot keizersnede
Naar boven komen van recessieve nadelige of lethale kenmerken bij het kweken naar homozygotie
Wat wordt verstaan onder een ‘transgene stam met harmful phenotype’?
- Een transgeen dier dat ongerief (pijn, stress, andere vorm van lijden of blijvend letsels) voortvloeiend uit de genetische wijziging ervaart, van een niveau gelijk of erger dan datgene veroorzaakt door de prik van een naald volgens goede veterinaire praktijk
- De kweek van zulke dieren moet vooraf door een ECD geauthoriseerd worden
- Vereist dus een goedgekeurd ethische projectbeschrijving
- Alle transgene dieren met harmful phenotype dienen als proefdier geregistreerd te worden
- Voor elk proefdier dient een ‘pijnscore’ (P-level) geregistreerd te worden
Wat is ‘genotypering’.
Labotest om uit te maken wat het genotype is van een dier
Bv. uitmaken of het dier wildtype, heterozygoot of homozygoot drager is van modificatie
Hoe verklaar je dat het voor genotypering ethischer kan zijn om een stukje van het distale teenkootje te nemen in plaats van een staartpuntje?
Leg uit.
Distale teenkootje gebruiken de dieren niet
Staartpuntje heeft wel nut bij de dieren
Welk percentage aan heterozygote, wildtypes en homozygote nakomelingen verwacht je bij een kweekschema waarbij je een Heterozygoot mannetje kruist met een Heterozygoot vrouwtje? Of waarbij je een HOMOZYGOOT vrouwtje kruist met een Heterozygoot mannetje?
- Hetero x hetero: 50% hetero, 25% homo en 25% wild
- Homo x hetero: 50% homo en 5% hetero
