3.3- PCR quantitatif Flashcards
PCR à temps réelle
même étapes que la PCR classique, mais utilise un marqueur fluorescent qui permet un suivit de la réaction et la quantification de l’amplicon synthétisé en temps réel
Que permet de faire la PCR à temps réelle
-obtention de la cinétique complète de la réaction de polymérisation permet d’obtenir une quantification absolue de la quantité initiale d’ADNcible
-permet de faire une quantification relative de gènes d’intérêts dans des échantillons donnés par rapport à un gène de référence non-régulé
-permet de faire la quantification absolue par rapport à un standard externe
comment fonctionne le SYBR Green
-détection de fragments double brin seulement, puisqu’il peut s’intercaler dans le duplex et émettre une fluorescence
-détection de sa fluorescence par une longueur d’onde effectué par lasers à l’intérieur de l’appareil PCR à temps réel qui traverse le tube de réaction PCR
-graphique peut être généré pour chaque échantillon d’analyse démontant la quantité de fluorescence en fonction des cycles PCR
qu’est-ce que le cycle seuil (Ct) pour une PCR à temps réelle
le nombre minimal de cycles nécessaires pour atteindre un niveau de fluorescence
pourquoi utiliser un intercalant fluorescent
pour la détection d’amplicons au fur et à mesure la duplication exponentielle des fragments d’ADNdb
Ct bas vs Ct élevé
bas= petit nombre de cycles de PCR pour atteindre un niveau déterminé de fluorescence, concentration élevé de matrice de départ
élevé= nombre élevé de cycles nécessaire pour atteindre la même intensité de fluorescence, concentration faible de matrice de départ
Désavantage de la PCR à temps réelle basée sur SYBR Green
SYBR Green peut donner un signal de fluorescence non spécifique lorsque les amorces s’hybrident de façon non-spécifique
principe du PCR à temps réel avec Taqman
quantification plus spécifique qui consiste à ajouter une sonde spécifique dirigée contre la région d’intérêt en plus des amorces spécifiques
-possède un élément quencher 3’ et un élément rapporteur 5’ de fluorescence quand les deux se trouvent à proximité
-cette sonde est inclue avec la paire d’amorces et s’hybride à la région amplifiée sur la matrice simple brin
-quand la sonde est attachée ou détachée de la matrice ADNsb, le quencheur atténue la fluorescence émit par le rapporteur
-pendant l’étape d’hybridation, la sonde et les amorces lient à l’ADNsb ciblé et l’ADNpol initie la polymérisation. ADNpol digère le bout 5’ de la sonde par activité exonucléase et libère la molécule de fluorescence et l’éloigne du quencher 3’ pour permettre un signal rapporteur qui est quantifié par l’appareil PCR à temps réel
désavantage de Taqman
doit changer de Taqman pour chaque réaction puisqu’il est dégradé par l’ADNpol
balise moléculaire
détecte de façon spécifique les produits de PCR
-même principe que Taqman, mais la sonde ne se fait pas dégradé et peut être recyclée
-sonde en forme de hairpin, rapporteur en 5’ et quencher en 3’, s’ouvre quand il s’hybride avec la région d’intérêt, permettant de séparer les deux molécules et d’émettre une fluorescence
PCR multiplex
-protocole PCR destiné à amplifier plus d’amplicon en ajoutant plus d’amorces
-produits seront compétitifs pour la polymérase, les dNTPs et le marqueur d’ADN
-peut se faire en point final ou en temps réel
