3.2- séquençage et clonage par PCR Flashcards
Séquençage d’un ADN
détermination de la succession des nucléotides le composant
Principe du séquençage sanger
synthétiser à partir d’un fragment d’ADN à séquencer, un ensemble de brins fils marqués à une extrémité et dont la longueur diffère d’un seul nucléotide du fragment voisin
Comment se fait la synthèse des brins fils tronqués?
-À laide de ddNTP, qui ne possèdent pas de groupement hydroxyle en 3’, contrairement au dNTP
-Ils peuvent être incorporés par l’ADNpol dans une chaîne d’ADN en élongation, mais ne peuvent pas former de liaison phosphodiester avec le prochain nucléotide après leur incorporation
-donc l’incorporation de ddNTP achève la synthèse de la chaîne, qui donne un brin fils tronqué
Comment fait-on pour déterminer la séquence complète d’un ADN après séquençage sanger?
-effectue 4 réactions différentes, chacune avec un type de ddNTP en ratios faibles avec les autres dNTP
-Le dNTP qui termine chaque fragment troqué peut être identifié en utilisant des ddNTPs marqués
-Chaque réaction se produit dans un tube différent, donc les ADN tronqués d’un tube se produit à tout les nucléotides de même nature
-en plaçant les 4 réactions de séquençage sure gel, on peut déterminer la séquence en regardant la taille des différents fragments migrés
Séquençage automatique
-marque les fragments d’ADN avec 4 colorants fluorescents différents
-dans un séquenceur automatique, les quatre mélanges réactionnels sont soumis à une électrophorèse sur gel et l’ordre d’apparition de chacun des colorants est enregistrée à l’extrémité du gel
-résultat présenté sous forme de courbes représentant la fluorescence détectée
Séquençage de nouvelle génération
réaction de séquençage à haut débit combinée avec la bioinformatique
séquence simultanément un ensemble de fragments d’intéret
isolement direct d’un segment spécifique d’ADN génomique par PCR
-deux amorces sont conçues pour s’hybrider à des séquences adjacentes à la région génomique recherchée et comprennent des séquences reconnues par des enzymes de restriction spécifiques
-après l’amplification de la séquence cible, le clivage par enzymes de restrictions appropriées produit des extrémités collantes qui permet la ligature efficace du fragment dans un vecteur plasmidique clivé par les enzymes de restriction correspondants aux sites dans le SCM
Réverse transcriptase PCR (RT-PCR)
-isolement d’un ARNm spécifique
-PCR suite à la transcription d’un ARNm en ADNc
PCR in situ
-PCR sur matériel biologique fixé
Differential display RT-PCR
expression différentielle de transcrits
étapes de l’isolement direct d’un segment d’ARNm par PCR
1-synthèse de l’ADNc: catalysée par la transcriptase inverse (transcriptase inverse, amorce poly T, désoxyribonucléotides)
2-la PCR: traitement de ARNase pour dénaturer le duplex ARN/ADNc ou inhibition de la réaction transcriptase inverse. Ensuite polymérase catalyse synthèse du 2e brin d’ADNdb en utilisant le premier brin (ADNc) comme matrice
transcriptase inverse
enzyme ADNpol ARN dépendantes capables d’utiliser un brin d’ARN comme matrice pour catalyser la synthèse du brin d’ADN complémentaire. Quand les ARN à amplifier sont polyadénylés en 3’, amorce choisit peut être une séquence poly T
Difficultés du RT-PCR et stratégies utilisées
-contamination des échantillons par ADN génomique, qui peut entrer en compétition avec ADNc lors de l’hybridation des amorces
stratégies:
-échantillons ARN totaux traités aux désoxyribonucléase pour éliminer ADN génomique
-choisir amorces dans deux exons différents adjacents d’un intron. Les produits d’amplification issus de l’ADNc et ceux issus d’ADN génomique contaminant seront distingués selon leur taille
-ARNm eucaryotes polyadénylés peuvent être purifiés par chromatographie de l’ARN cellulaire total sur une colonne ou sont immobilisés des oligo-dT
