3.1- Polymérases et PCR Flashcards
Réaction en chaîne de polymérases (PCR)
processus permettant de multiplier un fragment d’ADN choisi
permet de recopier in vitro un très grand nombre de fois en utilisant des ADNpol thermostables
Taq
enzyme de polymérase
ADN polymérase thermostable
catalyse la synthèse d’ADN à partir d’une amorce liée sur sa matrice
Qu’est-ce qu’est nécessaire pour initier la réaction de polymérisation d’un ADNpol
Un bout OH3’ libre sur une amorce et des ions Mg
Quels sont d’autres exemples d’ADNpol thermostables autre que Taq?
Pfx, Pfu, Vent
Quel ADNpol contient la plus haute fidélité des ADNpol thermostables?
Pfu, Pfx
Est-ce que Taq est une exonucléase?
non. donc il ne peut pas couper les liaisons phosphodiesters des OH aux extrémités, donc ne peut pas corriger ses erreurs de réplication
Fidélité enzymatique
évalué par le taux d’erreurs
ADNpol dépourvus d’Activité exonucléase 3’ - 5’ ont un taux d’Erreur plus élevé
Qu’Est-ce qu’on ajoute dans un incubateur pour une réaction PCR?
4 nucléotides (A,T,C,G)
ADNpol pour catalyser la réaction
Amorces d’ADN de séquences connues (18-20nt) qui vont s’hybrider aux régions monocaténaires de façon très spécifique et présenter une extrémité 3’-OH libre pour le recrutement de la pol
Nommer et décrire les 3 étapes de la PCR
1- dénaturation: dénaturation à 95°C qui provoque la séparation des deux brins de tous les fragments d’ADNdb
2- amorçage: processus d’hybridation à 55°C qui permet aux amorces de s’associer par complémentarité aux régions du fragment d’ADN que l’on veut amplifier
3-polymérisation: à 72°C la réplication du fragment d’ADN à partir des amorces avec l’intervention de l’ADNpol
amplicon
fragment amplifié par PCR
Rôle de MgCl2 dans la PCR
Mg2+ cofacteur essentiel à la polymérase
interagit avec les charges négatives de la chaîne d’ADN, limitant les forces de répulsion entre brins d’ADN et favorise la stabilité de l’hybridation
Plus sa concentration est importante, plus l’hybridation est facilitée (spécifique ou non). Une concentration trop forte peut mener à une augmentation de signaux aspécifiques
Tris-Cl
sert à tamponner le milieu réactionnel au niveau optimal pour l’activité de la Taq polymérase
Comment choisir la température d’hybridation
1- placer au Tm du couple d’amorces, si le Tm est différent pour les 2, utiliser le plus bas comme référence
2-choisir une température d’hybridation de 54°C comme point de départ, si amplifications non-spécifiques, augmenter par paliers de 2°C
Tm= 4°C(no G et C) + 2°C(no T et A)
Quelles caractéristiques sont recommandés pour une paire d’amorces?
-50% de GC et AT
-soit un G ou un C en 3’
-un Tm rapproché
Comment la séquence des amorces peut influencer la spécificité et l’efficacité de la PCR?
-accessibilité de la région d’amorçage
-amorçage non-spécifique
-formation de structures entre amorces (épingle à cheveux, homodimères, hétérodimères)
électrophorèse sur gel
-séparation des molécules d’ADN selon leur tailles
-à pH neutre, ADN à une charge fortement négative, donc se déplacent vers l’électrode positive quand le gel contenant les échantillons est submergé dans un tampon et soumis à un courant électrique
Visualisation par bromure d’éthidium
pour visualiser les bandes d’ADN séparées sur un gel, incube dans une solution de BrEt
Le BrEt fixe et s’intercale entre les paires de bases
quand le gel est illuminé par des rayons UV, les régions contenant de l’ADN émettent une fluorescence plus marquée que les régions dépourvus d’ADN
PCR niché
-amplification de la région amplifiée
-2 paires d’amorces sont utilisées: une première réaction utilise une paire dont la spécificité permet d’amplifier un petit nombre de séquences homologues
une deuxième réaction avec amorces internes aux premiers amplicons pour sur-amplifier la région d’intérêt
-amorces externes= 10 cycles
amorces internes= 25 cycles
-procédure pour la détection de régions de faibles concentrations
