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SBM-3002 Médecine moléculaire (Champ 2) > 3- CRISPR > Flashcards

3- CRISPR Flashcards

1
Q

Que veut dire l’acronyme CRISPR?

A

Clustered Regularly interspaced short palindromic repeats

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Q

Quelles sont les grandes étapes du fonctionnement de la machinerie CRISPR-Cas9?

A
  1. ARNg trouve et se lie à la séquence d’ADN auquel il est complémentaire
  2. Cas9 coupe les 2 brins d’ADN
  3. Cellule reconnait que l’ADN est endommagé et essaye de la réparer
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Q

Quelle est la limitation de la machinerie CRISPR-Cas9?

A

Cellule répare majoritairement avec le non-homologous end joining ce qui induit beaucoup de délétions et insertions

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4
Q

Quel est le PAM pour la Cas9 de la bactérie streptocoque pyogène?

A

NGG

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5
Q

Pourquoi est-ce que la cellule répare majoritairement avec le non-homologous end joining et non le homologous direct repair?

A

avec le HDR on doit fournir un gabarit à la cellule pour la réparation alors que NHEJ non

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6
Q

Comment fonctionne la méthode Guide-Seq?

A

On induit une cassure double-brin avec une cas9. Dans cette coupure, nous insérons un oligonucléotide qui est phosphorylé ce qui agit comme une étiquette et ensuite on peut séquencer cette région précise en raison de son étiquette

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7
Q

La méthode de Guide-Seq est surtout utilisée pour quoi?

A

détecter les événements d’édition du génome qui sont off-target sans devoir séquencer tout le génome

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8
Q

Quels sont les avantages de différentes Cas9?

A

elles reconnaissent différent PAM donc peuvent couper à différents endroits dans le génome

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9
Q

Quel est l’avantage de la saCas9?

A

elle est plus petite, donc plus facile à insérer dans les virus adéno-associés

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10
Q

Quelle est la réaction chimique lorsque l’on change une cytosine pour une thymine?

A

déamination

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11
Q

Quel est le désavantage/la limitation de l’utilisation du base editing?

A

l’édition se fait pour toute les bases cibles qui sont à une distance appropriée du PAM

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12
Q

vrai ou faux: le prime editing permet de changer n’importe quel nucléotide dans le génome humain par un autre nucléotide

A

vrai

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13
Q

De quoi est formée la machinerie du prime editing?

A

spCas9 nickase + Reverse transcriptase + pegRNA

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14
Q

Quelles sont les trois régions importantes du pegRNA?

A

PBS: primer binding site, se lie au brin coupé qui doit être corriger
RTT: reverse transcriptase template, est le gabarit pour la reverse transcriptase
Spacer: reconnait 20 nos dans le génome

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15
Q

Quelle est la limitation du prime editing?

A

la modification des nucléotides peut être perdue en raison de la résolution du “Flap”

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16
Q

Quelles sont les méthodes permettant l’amélioration du prime editing?

A
  1. Répéter le traitement
  2. Ajouter une cassure supplémentaire
  3. Muter le PAM après l’avoir reconnu
  4. Insérer une mutation additionnel (silencieuse ou non)
  5. Optimiser la longueur du RTT et PBS
  6. Utiliser un engineered pegRNA
  7. Utiliser Pemax
  8. Utiliser le bon type de cellules
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17
Q

De quoi est formé le PE3 ?

A

(PE2+Cas9)+(sgRNA+Cas9)

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18
Q

Comment fait le PE3 pour ajouter une cassure supplémentaire?

A

le sgRNA couplé à sa Cas9 reconnait le brin qui est non-corrigé et induit une coupure

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19
Q

Comment est-ce que l’utilisation du PE3 améliore le prime editing ?

A

la coupure du brin non-corrigé pousse la cellule à utiliser le flap 3’ contenant la mutation corrigée pour résoudre le problème des deux flaps

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20
Q

Comment est-ce que la mutation du PAM peut améliorer le prime editing?

A

en induisant une mutation dans le pam en meme temps de corrige la mutation voulue, ça fait en sorte que la machinerie Cas9 ne pourra pas se relier au brin et le re-editer

21
Q

Comment est-ce que l’utilisation d’un epegRNA améliore le prime editing?

A

le epegRNA contient un pseudoknot ce qui prévient sa dégradation par des exonucléases de la cellule

22
Q

Quelle est la différence entre le PE3 et le PEmax?

A

PEmax contient 2 mutations additionnelles pour prévenir son inhibition par des protéines MMR et elle contient des codons RT humanisés ce qui augmente son expression dans les cellules humains

23
Q

Quels vecteurs sont couramment utilisés en thérapie génique ?

A
  • Plasmides
  • AAV (Virus adéno-associés)
  • Lentivirus
  • Retrovirus
  • EVs (vésicules extracellulaires)
  • VLPs (Particules similaires aux virus = Vecteurs non viraux)
  • LNPs (Nanoparticules lipidiques)
24
Q

Quelle est la limitation de l’utilisation des AAV?

A

pour livrer la machinerie du prime editin,g 2 AAV doivent être utilisés ce qui diminue l’efficacité de l’édition

25
Q

Quelle est la différence entre la thérapie génique in vivo et ex vivo ?

A

In vivo : administration directe des vecteurs au patient.
Ex vivo : cellules modifiées en laboratoire puis réintroduites dans le patient.

26
Q

Quels sont les avantages des vecteurs AAV en thérapie génique ?

A

Expression stable, non intégrative (épisomale), faible immunogénicité et taille de 4,7 kb maximum.

27
Q

Quelle est la limitation principale de l’utilisation des plasmides pour la thérapie génique ?

A

Faible efficacité de transfection dans les cellules primaires et faible intégration dans le génome.

28
Q

Quelle technologie utilise une enzyme pour couper spécifiquement l’ADN à des endroits définis ?

A

CRISPR/Cas9, ZFN (Zinc Finger Nucleases), TALENs.

29
Q

Qu’est-ce que le prime editing ?

A

Une méthode d’édition génétique qui utilise Cas9 nickase et une transcriptase inverse pour corriger des mutations sans coupures double-brin complètes.

30
Q

Donne un exemple de thérapie génique approuvée utilisant un AAV.

A

La livraison efficace des composants génétiques et la gestion des réponses immunitaires.

31
Q

Quelles sont les applications cliniques de l’édition de base ?

A

Conversion de cytidine en thymine (CBE) et adénosine en guanine (ABE), utilisée pour corriger des mutations ponctuelles responsables de maladies héréditaires.

32
Q

Quel vecteur est associé à des risques de mutagenèse insertionnelle ?

A

Les rétrovirus, en raison de leur intégration dans le génome.

33
Q

Qu’est-ce que l’epegRNA et pourquoi est-elle importante ?

A

Une version améliorée de pegRNA qui augmente la stabilité et l’efficacité des modifications génétiques en prime editing.

34
Q

Comment fonctionne le saut d’exon dans la DMD ?

A

Masque les séquences exoniques pour restaurer le cadre de lecture et produire une protéine fonctionnelle.

35
Q

Quelle maladie est traitée avec la thérapie génique Luxturna ?

A

Dystrophie rétinienne due à une mutation du gène RPE65.

36
Q

Quelle est la principale différence entre les rétrovirus et les lentivirus ?

A

Les rétrovirus ne peuvent infecter que les cellules en division, tandis que les lentivirus (dérivés du VIH) peuvent infecter à la fois les cellules en division et quiescentes.

37
Q

Pourquoi l’adénovirus est-il utilisé en thérapie génique, malgré ses inconvénients ?

A

Il permet une expression à haut titre et n’intègre pas le génome, réduisant ainsi le risque de mutagenèse insertionnelle, bien qu’il provoque des réponses immunitaires.

38
Q

Quel est l’avantage des nanoparticules lipidiques (LNPs) par rapport aux vecteurs viraux ?

A

Elles présentent une meilleure biocompatibilité et réduisent le risque de réponses immunitaires par rapport aux vecteurs viraux.

39
Q

Qu’est-ce que l’épisomal signifie dans le contexte des vecteurs AAV ?

A

Cela signifie que l’ADN délivré reste séparé du génome de l’hôte et ne s’intègre pas, réduisant ainsi le risque de mutagenèse insertionnelle.

40
Q

Quel est le principal inconvénient des vecteurs AAV ?

A

Leur capacité limitée de 4,7 kb pour la taille du transgène, ce qui rend difficile l’encodage de gènes plus grands.

41
Q

Quelles sont les complications associées aux traitements utilisant des rétrovirus ?

A

Risque de développement de tumeurs en raison de l’intégration aléatoire près des oncogènes, comme observé dans les cas de X-SCID.

42
Q

Comment le CRISPR/Cas9 peut-il être utilisé pour traiter une maladie dominante ?

A

En ciblant et en inactivant spécifiquement l’allèle mutant responsable de la maladie.

43
Q

Quelle est la différence entre la réparation par jonction d’extrémités non homologues (NHEJ) et la réparation par recombinaison homologue (HDR) dans CRISPR ?

A

NHEJ répare de manière rapide mais souvent imprécise, tandis que HDR est précis mais nécessite un modèle d’ADN de réparation.

44
Q

Quel est l’objectif de l’édition de base dans le traitement des maladies héréditaires ?

A

Modifier directement une base spécifique sans créer de cassure double-brin, minimisant ainsi les risques de mutations hors cible.

45
Q

Qu’est-ce que le prime editing permet de faire que le CRISPR/Cas9 standard ne permet pas ?

A

Il permet des modifications précises, comme des insertions, des délétions et des substitutions spécifiques, sans coupure franche de l’ADN.

46
Q

Pourquoi les traitements de thérapie génique basés sur l’AAV peuvent-ils échouer chez certains patients ?

A

En raison de la présence d’anticorps préexistants contre les sérotypes AAV utilisés, limitant l’efficacité du vecteur.

47
Q

Quelles sont les avancées technologiques récentes pour améliorer la thérapie génique ?

A

Développement de vecteurs AAV modifiés, utilisation de LNPs pour la livraison d’ARNm, et amélioration des epegRNAs pour stabiliser l’édition génétique.

48
Q

Comment fonctionne la technique d’électroporation pour la délivrance de gènes ?

A

lle utilise des impulsions électriques pour créer des pores transitoires dans les membranes cellulaires, facilitant l’entrée de l’ADN.

49
Q

Pourquoi l’utilisation des endonucléases telles que TALENs et ZFNs est-elle plus limitée aujourd’hui ?

A

Leur conception est complexe et moins flexible par rapport à CRISPR/Cas9, qui est plus facile à programmer pour des cibles spécifiques.

SBM-3002 Médecine moléculaire (Champ 2) (7 decks)

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