2- Techniques de séquencage Flashcards
Qu’est-ce que le séquençage Sanger et comment fonctionne-t-il ?
Méthode de séquençage basée sur l’incorporation de didéoxynucléotides qui stoppent la synthèse d’ADN, permettant la lecture de la séquence après électrophorèse.
Quelles sont les limites du séquençage Sanger ?
Débit limité, coût élevé, et ne convient pas pour le séquençage de grands génomes en un temps raisonnable.
Qu’est-ce que le séquençage à haut débit (NGS) ?
Une technologie qui permet le séquençage de millions de fragments d’ADN simultanément, réduisant le temps et le coût par rapport au séquençage Sanger.
Quelles sont les étapes du séquençage à haut débit (NGS)
Fragmentation de l’ADN, préparation de librairies, capture/amplification, séquençage, et assemblage/alignement des séquences.
Comment fonctionne la méthode Illumina dans le séquençage NGS ?
Utilise un séquençage par synthèse avec des dNTPs fluorescents et l’amplification en cluster sur une flow cell pour obtenir des lectures.
Qu’est-ce que l’amplification pontée dans la méthode Illumina ?
Une technique permettant de créer des clusters d’ADN sur une flow cell, où chaque fragment est amplifié pour produire des milliers de copies.
Quelles sont les technologies de troisième génération de séquençage ?
PacBio (SMRT) et Oxford Nanopore, permettant le séquençage de molécules uniques avec des lectures longues.
Quel est l’avantage du séquençage PacBio (SMRT) ?
Permet de lire des séquences longues et de séquencer en temps réel, ce qui aide à résoudre des régions répétitives complexes.
Comment fonctionne le séquençage par Oxford Nanopore ?
L’ADN passe à travers un nanopore, et les changements de courant électrique sont mesurés pour déterminer la séquence.
Quels sont les avantages du séquençage par nanopore ?
Lectures ultra-longues, faible coût d’équipement, et capacité à séquencer en temps réel.
Qu’est-ce que le séquençage de novo ?
Le séquençage d’un génome sans référence préalable, nécessitant des lectures longues pour un bon assemblage.
Qu’est-ce que le pyroséquençage et quels sont ses inconvénients ?
Technologie qui mesure la lumière émise lors de l’incorporation de nucléotides. Limite : erreurs dans les homopolymères.
Comment fonctionne la technologie Ion Torrent dans le séquençage ?
Détecte les variations de pH générées par l’incorporation de nucléotides, sans utiliser de fluorochromes.
Qu’est-ce que la couverture de séquençage et pourquoi est-elle importante ?
Le nombre de fois qu’une base est lue pendant le séquençage. Une couverture élevée garantit la fiabilité et la détection des mutations rares.
Quelles sont les applications du séquençage NGS en médecine ?
Détection de mutations dans les cancers, séquençage de l’exome, analyse de l’ARN, et études génétiques des maladies héréditaires.
Qu’est-ce que le séquençage Shotgun et où est-il utilisé ?
Technique qui fragmente l’ADN de manière aléatoire pour le séquencer. Utilisée dans le séquençage de génomes entiers et la métagénomique.
Quelle est la différence entre le séquençage ciblé et le séquençage de l’exome ?
Le séquençage ciblé analyse des régions spécifiques, tandis que le séquençage de l’exome se concentre sur toutes les régions codantes du génome.
Qu’est-ce que la métagénomique et comment utilise-t-elle le séquençage NGS ?
Analyse des génomes de communautés microbiennes complètes dans un échantillon, permettant l’étude de la biodiversité et des épidémies.
Quels sont les défis du séquençage NGS ?
Coûts de traitement des données, stockage de grandes quantités de données, et besoin d’expertise en bioinformatique.
Comment la PCR en temps réel est-elle utilisée en préparation pour le séquençage ?
Elle permet de quantifier l’ADN ou l’ARN avant le séquençage pour assurer une quantité suffisante de matériel génétique.
Qu’est-ce que l’emPCR (PCR en émulsion) et à quoi sert-elle dans le séquençage ?
Une méthode d’amplification de fragments d’ADN en microgouttelettes, utilisée dans des technologies comme le pyroséquençage pour créer des millions de copies d’un fragment.
Quelle est la différence entre le séquençage par synthèse et le séquençage par ligation ?
Le séquençage par synthèse (ex : Illumina) incorpore des nucléotides marqués pour lire la séquence, tandis que le séquençage par ligation (ex : SOLiD) utilise des sondes oligonucléotidiques pour détecter des séquences par appariement.
Qu’est-ce que l’analyse de la méthylation de l’ADN et comment est-elle réalisée ?
Une technique pour étudier les modifications épigénétiques. Elle peut être réalisée par séquençage après traitement au bisulfite, qui convertit les cytosines non méthylées en uracile.
Quels sont les avantages du séquençage long-read par rapport au short-read ?
Les lectures longues facilitent l’assemblage de génomes complexes et permettent de résoudre des régions répétitives que les lectures courtes ne peuvent pas analyser.
Pourquoi le séquençage de l’ARN (RNA-seq) est-il important en biologie ?
Il permet de quantifier l’expression des gènes, de découvrir des transcrits inconnus et de caractériser des profils de transcription dans différents états cellulaires.
Comment le séquençage Nanopore peut-il être utilisé pour séquencer l’ARN directement ?
L’ARN peut passer directement à travers le nanopore, permettant la lecture en temps réel sans étape de transcription inverse.
Quelle est la méthode utilisée pour identifier des mutations rares dans des populations hétérogènes par NGS ?
Le séquençage profond (deep sequencing), qui augmente la couverture pour détecter des variantes à faible fréquence.
Qu’est-ce que le multiplexage en NGS et pourquoi est-il utilisé ?
Technique qui permet de séquencer plusieurs échantillons en même temps en les marquant avec des codes-barres uniques, réduisant les coûts et augmentant l’efficacité.
Quelles sont les erreurs courantes associées au séquençage par synthèse et comment sont-elles corrigées ?
Les erreurs peuvent inclure des insertions/délétions (indels) et des substitutions. Des logiciels de bioinformatique et des algorithmes d’alignement aident à les corriger.
Qu’est-ce que l’analyse de données bioinformatiques post-séquençage implique ?
Alignement des lectures sur un génome de référence, détection de variants, assemblage de novo, et analyse des profils d’expression pour le RNA-seq.
Quels sont les avantages du séquençage combiné (hybrid capture sequencing) ?
Il combine le séquençage ciblé et l’analyse de génomes entiers pour enrichir des régions d’intérêt tout en maintenant une couverture globale.
Comment la technologie de PacBio résout-elle les erreurs de séquençage liées aux homopolymères ?
Grâce à des lectures longues et à la technique de consensus circulaire (CCS), PacBio peut réduire les erreurs d’interprétation dans les régions homopolymères.
Qu’est-ce que la couverture de 30X signifie en séquençage d’exome ?
Chaque base de l’exome est lue en moyenne 30 fois pour assurer la précision dans la détection des mutations.
Pourquoi l’utilisation de contrôles internes est-elle importante en séquençage NGS ?
Pour vérifier la qualité des données et assurer la fiabilité des résultats tout au long du processus de séquençage.
Quelles sont les applications du séquençage de cellules uniques (single-cell sequencing) ?
Étude des profils d’expression génique à l’échelle cellulaire individuelle, identification des sous-populations cellulaires et analyse de la variabilité cellulaire.
