2- Techniques de séquencage

Question 1

Qu’est-ce que le séquençage Sanger et comment fonctionne-t-il ?

Answer 1

Méthode de séquençage basée sur l’incorporation de didéoxynucléotides qui stoppent la synthèse d’ADN, permettant la lecture de la séquence après électrophorèse.

Question 2

Quelles sont les limites du séquençage Sanger ?

Answer 2

Débit limité, coût élevé, et ne convient pas pour le séquençage de grands génomes en un temps raisonnable.

Question 3

Qu’est-ce que le séquençage à haut débit (NGS) ?

Answer 3

Une technologie qui permet le séquençage de millions de fragments d’ADN simultanément, réduisant le temps et le coût par rapport au séquençage Sanger.

Question 4

Quelles sont les étapes du séquençage à haut débit (NGS)

Answer 4

Fragmentation de l’ADN, préparation de librairies, capture/amplification, séquençage, et assemblage/alignement des séquences.

Question 5

Comment fonctionne la méthode Illumina dans le séquençage NGS ?

Answer 5

Utilise un séquençage par synthèse avec des dNTPs fluorescents et l’amplification en cluster sur une flow cell pour obtenir des lectures.

Question 6

Qu’est-ce que l’amplification pontée dans la méthode Illumina ?

Answer 6

Une technique permettant de créer des clusters d’ADN sur une flow cell, où chaque fragment est amplifié pour produire des milliers de copies.

Question 7

Quelles sont les technologies de troisième génération de séquençage ?

Answer 7

PacBio (SMRT) et Oxford Nanopore, permettant le séquençage de molécules uniques avec des lectures longues.

Question 8

Quel est l’avantage du séquençage PacBio (SMRT) ?

Answer 8

Permet de lire des séquences longues et de séquencer en temps réel, ce qui aide à résoudre des régions répétitives complexes.

Question 9

Comment fonctionne le séquençage par Oxford Nanopore ?

Answer 9

L’ADN passe à travers un nanopore, et les changements de courant électrique sont mesurés pour déterminer la séquence.

Question 10

Quels sont les avantages du séquençage par nanopore ?

Answer 10

Lectures ultra-longues, faible coût d’équipement, et capacité à séquencer en temps réel.

Question 11

Qu’est-ce que le séquençage de novo ?

Answer 11

Le séquençage d’un génome sans référence préalable, nécessitant des lectures longues pour un bon assemblage.

Question 12

Qu’est-ce que le pyroséquençage et quels sont ses inconvénients ?

Answer 12

Technologie qui mesure la lumière émise lors de l’incorporation de nucléotides. Limite : erreurs dans les homopolymères.

Question 13

Comment fonctionne la technologie Ion Torrent dans le séquençage ?

Answer 13

Détecte les variations de pH générées par l’incorporation de nucléotides, sans utiliser de fluorochromes.

Question 14

Qu’est-ce que la couverture de séquençage et pourquoi est-elle importante ?

Answer 14

Le nombre de fois qu’une base est lue pendant le séquençage. Une couverture élevée garantit la fiabilité et la détection des mutations rares.

Question 15

Quelles sont les applications du séquençage NGS en médecine ?

Answer 15

Détection de mutations dans les cancers, séquençage de l’exome, analyse de l’ARN, et études génétiques des maladies héréditaires.

Question 16

Qu’est-ce que le séquençage Shotgun et où est-il utilisé ?

Answer 16

Technique qui fragmente l’ADN de manière aléatoire pour le séquencer. Utilisée dans le séquençage de génomes entiers et la métagénomique.

Question 17

Quelle est la différence entre le séquençage ciblé et le séquençage de l’exome ?

Answer 17

Le séquençage ciblé analyse des régions spécifiques, tandis que le séquençage de l’exome se concentre sur toutes les régions codantes du génome.

Question 18

Qu’est-ce que la métagénomique et comment utilise-t-elle le séquençage NGS ?

Answer 18

Analyse des génomes de communautés microbiennes complètes dans un échantillon, permettant l’étude de la biodiversité et des épidémies.

Question 19

Quels sont les défis du séquençage NGS ?

Answer 19

Coûts de traitement des données, stockage de grandes quantités de données, et besoin d’expertise en bioinformatique.

Question 20

Comment la PCR en temps réel est-elle utilisée en préparation pour le séquençage ?

Answer 20

Elle permet de quantifier l’ADN ou l’ARN avant le séquençage pour assurer une quantité suffisante de matériel génétique.

Question 21

Qu’est-ce que l’emPCR (PCR en émulsion) et à quoi sert-elle dans le séquençage ?

Answer 21

Une méthode d’amplification de fragments d’ADN en microgouttelettes, utilisée dans des technologies comme le pyroséquençage pour créer des millions de copies d’un fragment.

Question 22

Quelle est la différence entre le séquençage par synthèse et le séquençage par ligation ?

Answer 22

Le séquençage par synthèse (ex : Illumina) incorpore des nucléotides marqués pour lire la séquence, tandis que le séquençage par ligation (ex : SOLiD) utilise des sondes oligonucléotidiques pour détecter des séquences par appariement.

Question 23

Qu’est-ce que l’analyse de la méthylation de l’ADN et comment est-elle réalisée ?

Answer 23

Une technique pour étudier les modifications épigénétiques. Elle peut être réalisée par séquençage après traitement au bisulfite, qui convertit les cytosines non méthylées en uracile.

Question 24

Quels sont les avantages du séquençage long-read par rapport au short-read ?

Answer 24

Les lectures longues facilitent l’assemblage de génomes complexes et permettent de résoudre des régions répétitives que les lectures courtes ne peuvent pas analyser.

Question 25

Pourquoi le séquençage de l’ARN (RNA-seq) est-il important en biologie ?

Answer 25

Il permet de quantifier l’expression des gènes, de découvrir des transcrits inconnus et de caractériser des profils de transcription dans différents états cellulaires.

Question 26

Comment le séquençage Nanopore peut-il être utilisé pour séquencer l’ARN directement ?

Answer 26

L’ARN peut passer directement à travers le nanopore, permettant la lecture en temps réel sans étape de transcription inverse.

Question 27

Quelle est la méthode utilisée pour identifier des mutations rares dans des populations hétérogènes par NGS ?

Answer 27

Le séquençage profond (deep sequencing), qui augmente la couverture pour détecter des variantes à faible fréquence.

Question 28

Qu’est-ce que le multiplexage en NGS et pourquoi est-il utilisé ?

Answer 28

Technique qui permet de séquencer plusieurs échantillons en même temps en les marquant avec des codes-barres uniques, réduisant les coûts et augmentant l’efficacité.

Question 29

Quelles sont les erreurs courantes associées au séquençage par synthèse et comment sont-elles corrigées ?

Answer 29

Les erreurs peuvent inclure des insertions/délétions (indels) et des substitutions. Des logiciels de bioinformatique et des algorithmes d’alignement aident à les corriger.

Question 30

Qu’est-ce que l’analyse de données bioinformatiques post-séquençage implique ?

Answer 30

Alignement des lectures sur un génome de référence, détection de variants, assemblage de novo, et analyse des profils d’expression pour le RNA-seq.

Question 31

Quels sont les avantages du séquençage combiné (hybrid capture sequencing) ?

Answer 31

Il combine le séquençage ciblé et l’analyse de génomes entiers pour enrichir des régions d’intérêt tout en maintenant une couverture globale.

Question 32

Comment la technologie de PacBio résout-elle les erreurs de séquençage liées aux homopolymères ?

Answer 32

Grâce à des lectures longues et à la technique de consensus circulaire (CCS), PacBio peut réduire les erreurs d’interprétation dans les régions homopolymères.

Question 33

Qu’est-ce que la couverture de 30X signifie en séquençage d’exome ?

Answer 33

Chaque base de l’exome est lue en moyenne 30 fois pour assurer la précision dans la détection des mutations.

Question 34

Pourquoi l’utilisation de contrôles internes est-elle importante en séquençage NGS ?

Answer 34

Pour vérifier la qualité des données et assurer la fiabilité des résultats tout au long du processus de séquençage.

Question 35

Quelles sont les applications du séquençage de cellules uniques (single-cell sequencing) ?

Answer 35

Étude des profils d’expression génique à l’échelle cellulaire individuelle, identification des sous-populations cellulaires et analyse de la variabilité cellulaire.