10. Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real Flashcards
qPCR tiene como objetivo no solo saber su un determinado adna esta presente, si no tambien poder determinar de forma
rapida, precisa y economica la cantidad de moleculas presentes inicialmente en la muestra
qpcr se ha convertido en la aplicacion de pcr mas utilizada en la lab de investigacion para el analisis genomico y
de expresion genica
utilizando arn como molde, la transcriptasa inversa se puede usar para generar una platilla de adn complementario (ADNc) para reacciones de qPCR; una estrategia denominada
retrotranscripci-qPCR (RT-qPCR)
un gen de expresion constitutiva no experimenta cambios
en la transcripcion
en el diagnostico molecular se puede utilizar para:
-determinar la carga viral del virus de are
-diagnosticar enfermedades por perfiles de expresión
el pcr convencional funciona bien para
detectar la presencia de adn al que reconocen específicamente el par de primers/cebadores
si la secuencia blanco no esta en el aún, no aparecerá
ningún amplicon en el gel agarosa
si en la muestra hay una sola molécula de adn que contiene la secuencia blanco, la amplificacion de
25-30 ciclos es suficiente para generar amplicones detectables mediante electroforesis en gel
la duplicación se relentiza a medida que:
-se agota la cantidad de dntps y cebadores
-and pol se vuelve menos activa después de ciclos de calentamiento
-eficiencia de duplicación se pierde
-ya no es proporcional a la cantidad de and molde (meseta/fase plateu) alcanzándose una determinada concentración máxima independiente
una ventaja de la pcr convencional es una mejor determinación de los
tamaños de los productos de amplificación mediante electroforesis en gel
la qpcr se basa en los mismos principios que la pcr
convencional
la qpcr permite detectar y medir acumulación del producto amplificado a medida que avanza cada uno de los ciclos de la reacción en
“tiempo real” y determinar el numero de copias inicial con precisión y alta sensibilidad
inicialmente la fluorescencia permanece en el fondo y los incrementos no son detectables en los ciclos
1-18
ciclo en el que se acumula suficiente producto amplificado para producir un señal fluorescente detectable
ciclo umbral o ct
esta determinado por la cantidad de moléculas molde presentes al comienzo de la reacción
ciclo umbral o ct
ct bajo
una gran cantidad requerida pocos ciclos de amplificación para acumular suficiente producto para dar una señal fluorescente por encima del fondo
los resultados de la pcr pueden ser cualitativos
presencia o ausencia de una secuencia
los resultados de la pcr pueden ser cuantitativos
numero de copias de adn
producto químico fluorescente que permite monitorear la amplificación de la secuencia blanco
syber-green l
se une a cualquier secuencia de and doble cadena (dsDNA) exhibiendo una fluorescencia 1000 veces mayor que cuando esta libre en solución
syber-green l
la recopilación de datos de fluorescencia se lleva a cabo en el termociclador para qPCR al final de cada etapa, consta de 3 pasas
excitacion
emisión
recolección
el instrumento ilumina todos los pocillos de la placa, excitando fluoroforos en cada reacción
excitacion
los fluoroforos emiten luz de una longitud de onda mayor de la que absorben al excitarse y la parte óptica del instrumento la filtra dentro de cierto rango de longitudes de onda
emisión
el instrumento ensambla una representación digital de la fluorescencia recolectada durante un intervalo de tiempo fijo
el software almacena la imagen fluorescente sin procesar para su análisis
emisión
principal desventaja de syber-green
falta de especificidad
principio de la curva de desnaturalización
la temperatura aumenta desde una temperatura baja donde todas las moléculas son doble cadena hasta una t° alta que provoca la disociación/desnaturalizacion de las hebras
a medida que el dsDNA se desnaturaliza, se libera syber green y se observa
disminución de la fluorescencia
factores importantes para la desnaturalización
tamaño del dsDNA
contenido de GC
cuanto mayor sea el contenido de GC y la longitud de duplex, mayor será
la t° de fusion/desnaturalizacion Tm
t° a la cual 50% del adn es bicentenario y 50% del adn se disocia en dna monocatenario
tm
el software grafica la primera derivada negativa de la tasa de fluorescencia frente a la temperatura
-dT(RFU)/dT
el software utiliza datos de calibración para determinar la intensidad de las señales fluorescentes en cada lectura y permite conocer los parámetros
-coherencia entre reacciones repetidas
-coherencia entre diluciones seriadas
-t° de fusion de los productos de amplificación
la cuantificación en tiempo real se basa en la relación entre
cantidad de adn molde inicial
valor de ct obtenido durante la amplificación
un ensayo de qPCR optimo es absolutamente esencial para una
cuantificación precisa de una muestra en particular
parametros caracteristicos de un ensayo de qPCR optimizado son
-coherencia entre reacciones repetidas (replicas)
-coherencia entre diluciones seriadas
se refiere a la reproducibilidad de la determinación de CT para una misma muestra determinada al emplear la misma cantidad teórica para diferentes reacciones que corren en paralelo bajo exactamente las mismas condiciones
coherencia de reacciones repetidas
cobra relevancia el correcto uso de las micropipetas y el que estas se encuentren debidamente celebradas para poder medir
micro volumenes de forma adecuada y reproducible
la serie de diluciones producirá curvas de amplificación
uniformemente espaciadas
una forma poderosa de determinar si su ensayo de qPCR esta optimizado es ejecutar un conjunto de diluciones seriadas del ADN molde, se puede emplear una muestra de cantidad desconocida de adn
coherencia de diluciones seriadas
si ocurre una duplicación perfecta con cada kilo de amplificación, el espaciado de curvas de fluorescencia estaba determinada por la ecuación
2*n= factor de diluciones
n es
el numero de ciclos entre curvas en el umbral de fluorescencia (la dif entre valores de Ct de las curvas)
las curvas de amplificación espaciadas uniformemente producirán
curvas estándar lineales
para determinación de la presencia o ausencia de una secuencia especifica de adn de una muestra biológica, se recopilan datos de fluorescencia necesariamente después de la PCR, de forma recomendable
antes de la reacción
*opcional, durante el desarrollo
es necesario correr a la par las muestras biológicas de interés, los respectivos controles + o - para descartar
falsos -
falsos +
el control + debe un resultado
+ asegurando que todo se ha llevado a cabo de forma correcta en la reacción
el control negativo que representa una reacción sin adn molde debe arrojar un resultado -
ausente de señal fluorescente, asegurando la no contaminación de las muestras
3 parametros para el:
-análisis de detección cuantitativa de secuencias blanco
-detección cualitativa de secuencias blanco
-identificación cualitativa del producto de pcr
e
