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Biologia molecular lab > 10. Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real > Flashcards

10. Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real Flashcards

1
Q

qPCR tiene como objetivo no solo saber su un determinado adna esta presente, si no tambien poder determinar de forma

A

rapida, precisa y economica la cantidad de moleculas presentes inicialmente en la muestra

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2
Q

qpcr se ha convertido en la aplicacion de pcr mas utilizada en la lab de investigacion para el analisis genomico y

A

de expresion genica

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3
Q

utilizando arn como molde, la transcriptasa inversa se puede usar para generar una platilla de adn complementario (ADNc) para reacciones de qPCR; una estrategia denominada

A

retrotranscripci-qPCR (RT-qPCR)

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4
Q

un gen de expresion constitutiva no experimenta cambios

A

en la transcripcion

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5
Q

en el diagnostico molecular se puede utilizar para:

A

-determinar la carga viral del virus de are
-diagnosticar enfermedades por perfiles de expresión

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6
Q

el pcr convencional funciona bien para

A

detectar la presencia de adn al que reconocen específicamente el par de primers/cebadores

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7
Q

si la secuencia blanco no esta en el aún, no aparecerá

A

ningún amplicon en el gel agarosa

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8
Q

si en la muestra hay una sola molécula de adn que contiene la secuencia blanco, la amplificacion de

A

25-30 ciclos es suficiente para generar amplicones detectables mediante electroforesis en gel

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9
Q

la duplicación se relentiza a medida que:

A

-se agota la cantidad de dntps y cebadores
-and pol se vuelve menos activa después de ciclos de calentamiento
-eficiencia de duplicación se pierde
-ya no es proporcional a la cantidad de and molde (meseta/fase plateu) alcanzándose una determinada concentración máxima independiente

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10
Q

una ventaja de la pcr convencional es una mejor determinación de los

A

tamaños de los productos de amplificación mediante electroforesis en gel

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11
Q

la qpcr se basa en los mismos principios que la pcr

A

convencional

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12
Q

la qpcr permite detectar y medir acumulación del producto amplificado a medida que avanza cada uno de los ciclos de la reacción en

A

“tiempo real” y determinar el numero de copias inicial con precisión y alta sensibilidad

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13
Q

inicialmente la fluorescencia permanece en el fondo y los incrementos no son detectables en los ciclos

A

1-18

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14
Q

ciclo en el que se acumula suficiente producto amplificado para producir un señal fluorescente detectable

A

ciclo umbral o ct

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15
Q

esta determinado por la cantidad de moléculas molde presentes al comienzo de la reacción

A

ciclo umbral o ct

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16
Q

ct bajo

A

una gran cantidad requerida pocos ciclos de amplificación para acumular suficiente producto para dar una señal fluorescente por encima del fondo

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17
Q

los resultados de la pcr pueden ser cualitativos

A

presencia o ausencia de una secuencia

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18
Q

los resultados de la pcr pueden ser cuantitativos

A

numero de copias de adn

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19
Q

producto químico fluorescente que permite monitorear la amplificación de la secuencia blanco

A

syber-green l

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20
Q

se une a cualquier secuencia de and doble cadena (dsDNA) exhibiendo una fluorescencia 1000 veces mayor que cuando esta libre en solución

A

syber-green l

21
Q

la recopilación de datos de fluorescencia se lleva a cabo en el termociclador para qPCR al final de cada etapa, consta de 3 pasas

A

excitacion
emisión
recolección

22
Q

el instrumento ilumina todos los pocillos de la placa, excitando fluoroforos en cada reacción

A

excitacion

23
Q

los fluoroforos emiten luz de una longitud de onda mayor de la que absorben al excitarse y la parte óptica del instrumento la filtra dentro de cierto rango de longitudes de onda

A

emisión

24
Q

el instrumento ensambla una representación digital de la fluorescencia recolectada durante un intervalo de tiempo fijo
el software almacena la imagen fluorescente sin procesar para su análisis

A

emisión

25
Q

principal desventaja de syber-green

A

falta de especificidad

26
Q

principio de la curva de desnaturalización

A

la temperatura aumenta desde una temperatura baja donde todas las moléculas son doble cadena hasta una t° alta que provoca la disociación/desnaturalizacion de las hebras

27
Q

a medida que el dsDNA se desnaturaliza, se libera syber green y se observa

A

disminución de la fluorescencia

28
Q

factores importantes para la desnaturalización

A

tamaño del dsDNA
contenido de GC

29
Q

cuanto mayor sea el contenido de GC y la longitud de duplex, mayor será

A

la t° de fusion/desnaturalizacion Tm

30
Q

t° a la cual 50% del adn es bicentenario y 50% del adn se disocia en dna monocatenario

A

tm

31
Q

el software grafica la primera derivada negativa de la tasa de fluorescencia frente a la temperatura

A

-dT(RFU)/dT

32
Q

el software utiliza datos de calibración para determinar la intensidad de las señales fluorescentes en cada lectura y permite conocer los parámetros

A

-coherencia entre reacciones repetidas
-coherencia entre diluciones seriadas
-t° de fusion de los productos de amplificación

33
Q

la cuantificación en tiempo real se basa en la relación entre

A

cantidad de adn molde inicial

valor de ct obtenido durante la amplificación

34
Q

un ensayo de qPCR optimo es absolutamente esencial para una

A

cuantificación precisa de una muestra en particular

35
Q

parametros caracteristicos de un ensayo de qPCR optimizado son

A

-coherencia entre reacciones repetidas (replicas)
-coherencia entre diluciones seriadas

36
Q

se refiere a la reproducibilidad de la determinación de CT para una misma muestra determinada al emplear la misma cantidad teórica para diferentes reacciones que corren en paralelo bajo exactamente las mismas condiciones

A

coherencia de reacciones repetidas

37
Q

cobra relevancia el correcto uso de las micropipetas y el que estas se encuentren debidamente celebradas para poder medir

A

micro volumenes de forma adecuada y reproducible

38
Q

la serie de diluciones producirá curvas de amplificación

A

uniformemente espaciadas

39
Q

una forma poderosa de determinar si su ensayo de qPCR esta optimizado es ejecutar un conjunto de diluciones seriadas del ADN molde, se puede emplear una muestra de cantidad desconocida de adn

A

coherencia de diluciones seriadas

40
Q

si ocurre una duplicación perfecta con cada kilo de amplificación, el espaciado de curvas de fluorescencia estaba determinada por la ecuación

A

2*n= factor de diluciones

41
Q

n es

A

el numero de ciclos entre curvas en el umbral de fluorescencia (la dif entre valores de Ct de las curvas)

42
Q

las curvas de amplificación espaciadas uniformemente producirán

A

curvas estándar lineales

43
Q

para determinación de la presencia o ausencia de una secuencia especifica de adn de una muestra biológica, se recopilan datos de fluorescencia necesariamente después de la PCR, de forma recomendable

A

antes de la reacción

*opcional, durante el desarrollo

44
Q

es necesario correr a la par las muestras biológicas de interés, los respectivos controles + o - para descartar

A

falsos -
falsos +

45
Q

el control + debe un resultado

A

+ asegurando que todo se ha llevado a cabo de forma correcta en la reacción

46
Q

el control negativo que representa una reacción sin adn molde debe arrojar un resultado -

A

ausente de señal fluorescente, asegurando la no contaminación de las muestras

47
Q

3 parametros para el:

A

-análisis de detección cuantitativa de secuencias blanco
-detección cualitativa de secuencias blanco
-identificación cualitativa del producto de pcr

48
Q

e

A

Biologia molecular lab (7 decks)

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