1 Flashcards
kaj so mikroorganizmi
- mikroskopsko majhni organizmi
- enocelični
- večcelični (agregati)
to so bakterije, arheje, glive (kvasovke) , nekatere alge, in protozoji
kaj je genetika
veda, ki preučuje zgradbo in funkcijo DNA ter prenos informacij v naslednjo generacijo.
katere tipe raziskav DNA poznamo
- metagenomske: celokupna DNA več organizmov
- genomske: na ravni enega organizma /celice (kromosomi, plazmidi, virusi, mtDNA, cpDNA, fagi, integroni, geni, medgenska DA in transpozicijski elementi)
- klasične
kako določimo pozicijo genov na DNA
z rekombinacijami
kako določimo zaporedje nukleotidov
s sekvenciranjem
sekvenciranje Sanger
metoda za določanje nukleotidnega zaporedja do 1000 nukleotidov (kratka zaporedja). postopek:
1. PCR pomnožitev odseka DNA ki ga želimo sekvencionirati.
2. sinteza fragmentov. potrebujemo pomnoženi odsek, začetne olige, polimerazo, dNTP in fluorescenčno označene dNTP (ddNTP). ddNTP na 3’ koncu nimajo hidroksilne skupine zato se z njihovo vezavo izgrajevanje verige konča. dNTP in ddNTP tekmujejo za vezavo zato nastanejo različno dolgi fragmenti.
3. ločimo fragmente s kapilarno elektroforezo in na koncu gredo čez laser, ki zazna fluorescenco zadnjega ddNTP
NGS: pirosekvenciranje
- DNA pomnožimo s PCR
- DNA se pretvori v ssDNA
- oligonukleotidni prajmerji se komplementarno hibridizirajo na verigo
- pirosekvenciranje: encimska reakcija pri kateri mešanica encimov in substratov katalizira sintezo komplementarnih nukleotidov. v reakcijsko mešanico doajajmo vsako bazo posebej v obliki NUKLEOZID TRIFOSFATA. ko se vgradi nukleotid se sprosti PIROFOSFAT. zaradi pirofosfata ATP SULFURILAZA pretvori APS v ATP. ker je prisoten ATP encim LUCIFERAZA oksidira luciferin in ob tem se sprosti svetloba. to zaznamo kot “peak” na pirogramu.
NGS platforme
ilumina
ion torrent
–> veliko genomskih sekvenc in razmah metagenomskih študij
nanopore
odpravi težave ponavljajočih zaporedij.
dvoverižno DNA vlečemo skozi poro, ki dovolj majhna da gre skoznjo le 1 veriga DNA, kar pomeni da jo moramo prej denaturirati.
naredimo gradient ionov ob membrani, kar ustvari elektronski tok skozi poro. vsakič ko gre nukleotid skozi poro se pretok ionov zmanjša. upad toka ionov je odvisen od oblike nukleotida, ker da vsak drugačen signal (nabitost membrane)
katere načine sekvenciranja poznamo
sanger
pirosekvenciranje
tiha biosinteza
z uporabo nanopor
kateri načini sekvenciranja so primerni za daljše fragmente
tiha biosinteza
nanopore
—> bistveno boljše sekvence izvenkromosomskih fragmentov (plazmidi in fagi)
prve genomske sekvence - organizmi
Haemophilus influenzae
Mycoplasma genitalium
prva primerjava genomov dveh bakterijskih VRST- katerih, kdaj, kaj so ugotovili
Mycoplasma pneumoniae in Mycoplasma genitalium
1997
ugotovitve: vsi CDS iz MG so v MP. v nekaterih primerih je spremenjen vrstni red (kromosomske preureditve). V MP so tudi dodatni in novi CDS
to je omogočilo nastanek prve primerjalne genomske študije: razlike med vrstami/sevi, pojasni kako so nastale evolucijske spremembe.
prva primerjava genomov na ravni SEVOV - kateri organizem, ugotovitve
Helicobacter pylori
ugotovitve: sevno specifični CDS-jev je 6-7%. polovica od teh je v eni HIPERVARIABILNI REGIJI, ki se razlikuje med sevoma.
prvi sekvencirani bakterijski modelni organizmi
Bacillus subtilis
E. coli
opiši evkariontski genom
- različno veliki
- različen % GC
- različen % intergenskih regij
- različen % eksonov in intronov
opiši prokariontski genom
- različno veliki
- različen % GC
- različen % horizontalno prenesene DNA
- plazmidi, Tn elementi, fagi, genomski otoki, integroni
kaj je doprineslo analiziranje genomov
pokaže da obstaja genetska raznolikost med vrstami, sevi in znotraj sevov. sprva so mislili da k evoluciji največ vplivajo točkovne mutacje, potem pa so ugotovili da k spreminjanu genomov prispevajo tudi transpozicijski dogodki, integracije in izrezovanje fagov, genomski otoki,…
podatkovna baza GOLD
katalog geomskih in metagenomskih projektov
microbes online
orodja za primerjavo mikrobnih genomov in transkriptomov
kaj lahko oteži analizo genomov pri bakterijah
mobilni genetski elementi
multipartitni bakterijski genomi
kako lahko bakterije prenesejo svojo DNA
horizontalno (z mobilnimi genetskimi elementi) in vertikalno
načini horizontalnega prenosa genov
transdukcija
konjugacija
transformacija
mobilni genetski elementi
plazmidi
fagi
konjugativni transpozoni
transpozoni
genomski otoki
pangenom
je celoten genom vrste
ortologi (ortologni geni)
geni različnih vrst, ki so nastali iz enega gena zadnjega skupnega prednika
core genom
skupen vsem izolatom
multipartitni bakterijski genomi
- 10% bakterijskih genomov je razdeljenih v dva ali več velikih molekul DNA
- najdemo jih v “pomembnih” bakterijah: dušik fiksirajoče bakterije, rastlinski in človeški patogeni
- pomembne celične funkcije so zapisane na več replikonih
ključ za določanje molekul DNA
bakterijski replikon:
1. kromosom
2. sekundarni replikon: sekundarni kromosom, kromid (imata bistvene core gene), megaplazmid, plazmid
