Week 4 Flashcards
Welke cellen zitten in de darm crypten?
Va onderin:
-Paneth cellen
-Stamcellen
-Voorlopercellen (proliferatie)
Differentiatie bovenin:
-Gobletcel
-Enterocyt
-Enteroendocriene cel
Welke cellen zitten in de niche?
Stamcellen en paneth cellen
Wat is de functie van paneth cellen?
-Secreteren WNT factor: stamcellen onderhouden en proliferatie ondersteunen
-Secreteren lysozym dat lokaal bacterien afbreekt
Waar heeft WNT zijn effect?
Lokaal in de niche
Beschrijf de WNT pathway in afwezigheid van WNT
-WNT receptor
-In cytoplasma B-catenine afgebroken in kleine stukjes door destructie complex met APC
-TcF op DNA, heeft binding B-catenine nodig
-Zonder WNT geen transcriptie-> geen proliferatie
Welke 2 functies heeft b-catenine?
- WNT pathway transcriptie regulatie (cytoplasma, kern)
- cel-cel adhesie (membraan). Ook E-cadherine betrokken
Beschrijf de WNT pathway in aanwezigheid van WNT
- WNT bindt aan WNT receptor
- Destructie complex valt uiteen
- Hoger concentratie B-catenine
- Diffundeert naar kern en bindt aan TcF (transcriptiefactor)
- Transcriptie leidt tot celproliferatie
Wat is de functie van WNT in stamcellen?
Faciliteren van asymmetrische deling van de stamcel als dat nodig is:
-Signalen naar WNT kant-> rangschikking centrosomen
-Offspring aan WNT kant blijft stamcel, andere kant differntieert
Waarom werkt WNT alleen lokaal?
WNT eiwitten hebben een lipidegroep en binden daarmee aan de celmembraan
Hoeveel van de darmkankergevallen zijn erfelijk?
15% erfelijk, 85% sporadisch
Wat is de achterliggende mutatie van familiaire adenomateuze poliposis (FAP)?
Mutatie in APC gen
Wat zijn de kenmerken van FAP?
Autosomaal dominante predispositie voor de ontwikkeling van multipele
adenomateuze poliepen in colon en rectum.
Ook verhoogd risico op andere tumoren.
Ontstaat op relatief jonge leeftijd (tussen 20 en 30 jaar).
Klinische variabiliteit in leeftijd waarop de eerste symptomen optreden,
aantal poliepen in de darm, soort en aantal andere tumoren (genotype-
fenotype relatie).
Wat is de belangrijkste mutatie bij darmkanker?
APC gen (85%):
-Sporadische APC mutaties bij meeste sporadische patienten
-Kiembaan APC mutaties
Wat zijn de gevolgen van een APC mutatie voor de WNT pathway?
Het APC tumorsuppressor gen wordt geinactiveerd.
Hierdoor werkt het destructiecomplex niet meer.
De β-catenine concentratie stijgt.
Door de hoge β-catenine concentratie gaat β-catenine ook naar de kern.
Daar vormt β-catenine een complex met TCF.
β-catenine en TCF samen activeren transcriptie.
Welke mutatie komt in 5% van de CRC gevallen voor?
Er treedt een oncogene mutatie op in het β-catenine gen (herkenningssite voor APC)
β-catenine wordt niet meer door APC herkend en kan niet meer worden afgebroken door het destructie complex.
Wat zijn de downstream targets van WNT?
- WNT
- APC (tumorsuppresorgen)
Oncogenen: - B-catenine
- TCF4
- Cycline D/ CDK4/ MYC/ LGR5
Wat zijn de functies van de B-cetenine-TCF target genen?
Cycline D en CDK4: activering cel cyclus
MYC: Hoge expressie leidt tot korte duur van de G0 fase van de cel cyclus
MYC activeert expressie van CDKs en inactiveert CDKIs
LGR5: belangrijk voor onderhouden stamcel karakter
Hoelang duurt het gemiddeld voor een darmcarcinoom ontstaat en waarom?
17 jaar
-APC geeft eerste begin extra proliferatie waardoor grotere kans om andere mutaties te accumuleren. Voor kanker 3-5 mutaties nodig wat tijd kost
Wat zijn de kenmerken van het bevolkingsonderzoek darmkanker?
Doel: 2400 minder sterfgevallen per jaar
Leeftijdsgroep: 55-75 jaar: 1X per 2 jaar onderzoek ontlasting
Occult bloed in de ontlasting
Wat is de rol van COX-2 bij CRC?
Productie door tumorcellen en inflammatie
Induceert Prostaglandine E2 (PGE2) productie
Activeert WNT signaling
Welk middel kan worden gebruikt om darmkanker te voorkomen en remmen?
Aspirine (NSAID) remt COX-2-> minder ontwikkeling van darmkanker en hogere overall survival
Wat is de oorzaak van polycytemia vera (PV)?
JAK pathway continu actief-> te veel ery’s
Wat zijn symptomen van polycytemia vera?
-Hoofdpijn
-Vermoeidheid
-Rood gelaat
-Pijn in benen en handen
-Jeuk
Welke ziektes behoren tot de myeloproliferatieve neoplasieen (MPN)?
-Polycytemia vera (PV)
-Essentiele trombocytose (ET)
-Myelofibrose (MF)
Wat is er aan de hand bij myeloproliferatieve neoplasieen?
Proliferatie (overproductie) in BM van een of meerdere myeloide lijnen. Min of meer normale uitrijping
-Clonale hemapatopoetische stamcelziektes
Wat is primaire myelofibrose?
Fibrosering beenmerg-> bloedcelvorming verplaatst zich naar andere organen zoals de milt of lever
Wat zijn de gemeenschappelijke kenmerken van myeloproliferatieve neoplasieen?
- Hypercellulaire BM
- Megakaryocyten hyperplasie en dysplasie
- Spontane groei zonder GF
- Spontane transformatie naar beenmergfibrose of acute leukemie
Hoe ontwikkelen myeloproliferatieve neoplasieen zich?
Ze kunnen in elkaar overgaan:
-ET->OV
-Post PV myelofibrose bij langer bestaand PV
-Verhoogd risico op AML, vooral bij MF
Wat zijn de klinische gevolgen van myeloproliferatieve neoplasieen?
- Verhoogd risico op trombose
- Bloedingen. Verworven ziekte van Von Willebrand omdat zeer hoge bloedblaatjes VWF absorberen
- Ziekte progressie (BM fibrose/ extra-medullaire hematpoiese/ leukemische transformatie)
Welke klachten passen bij een myeloproliferatieve neoplasie?
-Moeheid
-Pruritus
-Nachtzweten
-Botpijn
-Koorts
-Gewichtsverlies
Wat is de levensverwachting van myeloproliferatieve neoplasieen (MPN)?
- ET bij goede behandeling normaal
- PV: verkort, maar tientallen jaren
- MF: sterk verkort, gemiddeld 7 jaar overleving
Welke mutaties komen voor bij myeloproliferatieve neoplasieen?
-JAK2 (vooral bij PV)
-CALR
-MPL
Hoe wordt PV gediagnosticeerd?
-Bloed + beenmergpunctie
-Bij verhoogde ery’s + JAK2 mutatie geen beenmergpunctie nodig
Wat zijn de gevolgen van een JAK2 mutatie voor het ziektebeloop van MPN?
Hoger risico op trombo-embolische complicaties en ernstigere ziektebeloop
Hoe worden myeloproliferatieve neoplasieen behandeld?
- Aspirine: plaatjes aggregatie remming. Vermindert klachten als pijnlijke rode handen en kans op trombose
- Bij mensen met extra hoog risico op trombose hydroxyureum, interferon, anagrelide (zeldzaam 32P-therapie radioactief fosfor)
- MF en slecht levensverwachting: overweeg allogene stamceltransplantatie, risico’s
- Bij PV: aderlaten (hematocriet beheren)
Welk aanvullend geneesmiddel kan gegeven worden bij een JAK2 mutatie?
Ruxolitinib (JAK2 remmer, JAKavi): productie ery’s en klachten nemen af, aderlatingen niet meer nodig, goed effect op kwaliteit van leven
Hoeveel genen zitten er in het menselijk genoom?
~20.000
Wat is epigenetica?
Alle genen hebben dezelfde genetische informatie maar ontwikkelen verschillend omdat genen aan of uit kunnen staan, hard of zacht aanstaan. Epigenetica doorgegeven aan dochtercellen waardoor bv een huidcel een huidcel blijft. Eigen genexpressieprofiel
Hoe wordt MDS behandeld?
5-azacytidine, groep patienten reageert daar goed op
Wat is MDS?
Myelodysplastisch syndroom:
-Klonale ziekte van de hemapoietische stamcel
-Cytopenie in 1+ cellijnen evt met dysplastische kenmerken, max 20% blasten
-Beenmerg net dysplastische kenmerken in 1+ cellijnen, max 20% blasten
-Vaak ineffectieve hematopoiese
Welk ziektebeeld wordt gekenmerkt door >20% blasten?
Acute myeloide leukemie
Waaruit bestaat een nucleosoom?
-DNA
-Histonen
-Andere eiwitten
Welke 2 soorten chromatine zijn er?
Euchromatine: open chromatine, in deze staat kunnen genen worden afgeschreven.
Heterochromatine: gesloten chromatine, genen kunnen niet tot expressie komen
Welke 2 vormen van epigenetische regulatie zijn er?
- DNA methylering
- Histon-modificatie
Wat zijn de effecten van DNA-methylering?
DNA van open-> gesloten (heterochromatine)
Waar vindt DNA-methylering plaats?
C5 van cytosine in 5’-CG-3’ wordt vervangen door CH3. CH3 is aangrijpingspunt voor eiwitten die het chromatine kunnen inpakken (methyl binding proteins)
Wat is cytidine?
Cytosine gebonden aan suiker in DNA
Welke enzymen zorgen voor methylering van DNA?
DNA methyl transferases (DNMT), methylgroep uit SAM (co-factor)
Wat is de rol van hypermethylatie in het ontstaan van kanker?
Bij veel genen is er een CG eiland in de promotor van het gen. Bij methylering kan transcriptiefactor niet meer binden waardoor de gen uit gaat. Als dit genen die belangrijk zijn voor bv de ontwikkeling heeft dit een groot effect op functioneren en ontwikkeling cel
Welke vormen van methylering zijn er?
-De novo methylering
-Maintenance methylering: voor in stand houden van methylering in cellijn, na DNA replicatie
Hoe werkt 5-Azacytidine?
Het is een cytidine waarbij C5 is vervangen door N-> kan niet gemethyleerd worden. Als - ingebouwd kan maintenance methylase niet methyleren-> na aantal delingen genen aan. Toegepast bij MDS: veel genen zijn gemethyleerd in patienten. Behandeling geeft verlies DNA methylatie
Hoe werkt histon-modificatie?
Acetylering van chromatine-> DNA open.
Deacetylering-> chromatine sluit
Histon-modificatie in ZO
Hoe werkt de vorming van bloedcellen?
Voorlopercellen hebben allemaal eigen specifieke receptor->activatie bij binding GF-> vermenigvuldigen en verdere ontwikkeling (celdeling en activatie van genen)
Welke groeifactoren zijn betrokken bij de vorming van bloedcellen?
Ery’s: EPO
Granulocyten: G-CSF
Bloedlaatjes: TPO
Wat zijn de 3 hoofdgroepen membraanreceptoren?
- Ion-kanaal gebonden
- Eiwit-gebonden
- Enzym-gebonden
Hoe werken enzym-gekoppelde receptoren?
- Signaalmolecuul bindt aan de dimeer receptor en activeert deze: gaat dimeriseren
- Actieve katalytische domein
Wat voor receptoren zijn groeifactorreceptoren?
Receptor tyrosine kinases (enzym-gebonden): receptoren met IC een kinase domein die geactiveerd wordt door binding GF-> gaat downstream targets fosforyleren
Welke receptor tyrosine kinases zijn er?
EGF-R
FGF-R
Ins-R
cKit
FLT3
MCSF-R
PDGF-R
Welke fout kan optreden in een tyrosine kinase receptor?
-FLT3 komt tot expressie in vroege hemapoeietische stamcellen
-In 20-30% AML patienten mutatie: FLT3-ITD
-ITD (duplicatie aminozuren) in JM domein veroorzaakt spontane activering van het FLT3 receptoreiwit-> spontane celdeling van AML cellen
Welke receptoren zijn betrokken bij het hemapoetische systeem?
-Receptor tyrosine kinases
-Non-RTK
Wat voor receptoren zijn cytokine receptoren?
-Non-RTK
-Werken later in hemapoetische systeem
-Geen tyrosine kinase domein, hebben docking site waar JAK eiwit aan gaat zitten (kinase)
Welke non-RTK receptoren zijn er?
EPO-R
GCSF-R
TPO-R
IFNa/b-R
IFNg-R
Hoe geven enzym-gebonden receptoren hun signaal door?
Eiwitkinase hangt fosfaatgroep aan serine, tyrosine (tyrosine kinases/ fosfatases) of threonine (serine/threonine fosfatases/kinases).
-ATP + aminozuur-> aminozuur + H2O + ADP
Fosfatases kunnen ze later defosforyleren om ze te deactiveren
Wat zijn de eigenschappen van intrinsieke receptoren voor bloedcelgroeifactoren?
Geen intrinsieke tyrosinekinase activiteit (zoals bv. FLT3), maar activeren JAK tyrosine kinases/ Janus kinases
Activatie van JAKs vindt plaats in trans (“cross”), na
receptor-dimeervorming en conformatie verandering
Wat is de functie van JAKs?
JAKs fosforyleren tyrosines in receptor ketens en in signaaleiwitten. Dit activeert de functie van deze signaaleiwitten, wat leidt tot verschillende cellulaire
responsen (transcriptie, translatie, proliferatie, differentiatie, celoverleving, metabolisme)
Wat zijn de gevolgen van afwijkingen in receptoreiwitten en JAKs?
Afwijkingen in receptoreiwitten en JAKs en cytoplasmatische tyrosine kinases zijn betrokken bij verschillende bloedziekten en vormen een doelwit voor gerichte (“targeted”) therapie
Welke storingen in receptor functie/ tyrosine kinase activiteit kunnen leiden tot Acute lymfoblasten leukemie (ALL)?
Mutatie in IL-7 receptor, JAK2
Welke storingen in receptor functie/ tyrosine kinase activiteit kunnen leiden tot myeloproliferatieve aandoeningen (PV, ET, PMF)?
Mutatie in JAK2, TPO-R (MPL)
Welke storingen in receptor functie/ tyrosine kinase activiteit kunnen leiden tot chronische myeloide leukemie?
Mutatie in Abl tyrosine-kinase (bcr-abl)
Welke storingen in receptor functie/ tyrosine kinase activiteit kunnen leiden tot chronische neutrofiele leukemie (CNL)?
Mutatie in G-CSF receptor
Beschrijf de signaal transductie door een G-CSF receptor
- Binding G-CSF zorgt voor dimerisatie van de receptor
- Cross-fosforylering (activering) van JAKs
- Binding aan dockingplaatsen en activering van signaaleiwitten (cross-fosforylering van target eiwitten)
Welke mutatie geeft chronische neutrofiele leukemie (CNL)?
CSF3R mutaties:
-Mutatie in G-CSF receptor waardoor er spontane dimeervorming van de receptor is
-JAKs actief zonder G-CSF binding
-G-CSF onafhankelijke proliferatie
Hoe geven JAKs het signaal door aan downstream eiwitten?
- JAKs fosforyleren sites op de receptor (tyrosine) waardoor tryosine een dockingsite wordt
- SH2 domein van signaal eiwit past precies op P-Y en 3 opeenvolgende aminozuren
in de receptor
Wat veroorzaakt de specificiteit van eiwitten met een SH2 domein?
Verschillende SH2 domeinen herkennen verschillende P-Y-A1A2A3 codes
Wat is de rol van fosfatases bij het uitzetten van receptorsignalen?
Fosfatases halen fosfaat eraf waardoor eiwitten met SH2 domein niet meer kunnen binden
Hoe wordt EPO signalering beëindigd?
Door SHP1: remt JAK2 en verwijdert de fosfaatgroep-> terminatie signaal van EPO. Als dit niet goed werkt ontstaan er meer ery’s
Welke myeloproliferatieve aandoengen (MPN) zijn er?
- Polycytemia Vera (PV)
- Essentiele Trombocytose (ET)
- Primaire Myelofibrose (PMF)
Welke mutaties komen voor bij patienten met myeloproliferatieve aandoeningen?
JAK2, CALR en MPL mutaties
Hoe werkt Sanger sequencing?
- Denaturatie DNA + primer toevoegen
- Polymerase reactie met nucleotiden + nucleotiden met een kleurtje waarbij de reactie stopt
- Houdt DNA stukjes van verschillende lengtes over.
- Gel electroforese, met laser volgorde afgelezen
Single gene sequencing
Hoe wordt CML behandeld?
Imatinib
Hoe ontstaat Imatinib resistentie?
Mutaties in het Abl1 gedeelte van het BCR/ABL fusie-eiwit. Sanger sequencing om te bepalen welke alternatieve middel gebruikt kan worden
Hoe werkt next generation sequencing (NGS)?
- Flowcell met linkers + DNA stukjes met aan beide kanten adaptors. Adaptors binden aan complementaire linkers.
- PCR reactie waarbij fragmenten op cel worden vermenigvuldigd (cluster growth).
- Enkelstrengs degeneratie, daarna polymerase nucleotiden inbouwen met verschillende kleuren. Foto per ingebouwde nucleotide
Welke mutatie komt vaak voor bij polycythemia vera?
JAK2-V617F mutatie in het JH2 pseudokinase
domein van het JAK2 eiwit dat kinase controleert
Mutatie heft de remmende werking van het JH2 domein op waardoor er overactivatie van het kinase domein is-> overproductie ery’s
Wat is het effect van een JAK2-V617F mutatie in MPN?
JAK2-V617F mutatie vernietigt remmende werking van het JH2
(pseudokinase domein), resulterend in hypersensitieve en
gedeeltelijk groeifactor-onafhankelijke signalering, ihb van de EPO receptor en de TPO receptor (spontane activering)
Waar worden JAK2-V617F mutaties waargenomen?
In verschillende
vormen van MPD: Polycythemia vera (PV), essentiele thrombocytose (ET), primaire myelofibrose (PMF): heterogene
genotype/fenotype correlatie
Welke routes kan een cel kiezen bij cellulaire stress/ DNA schade?
- Apoptose
- Senescence
Wat is het belang van apoptose?
- Celdood en celproliferatie zijn in balans gedurende het leven van een multicellulair-organisme
- Celproliferatie en celdifferentiatie maar ook celdood horen bij de normale ontwikkeling van zoogdieren
- De meeste celdood gebeurt door een normaal proces van
geprogrammeerde celdood, apoptose - Apoptose is streng gereguleerd
Welke 2 vormen van celdood zijn er?
- Apoptose
- Necrose
Wat zijn de kenmerken van apoptose?
-Gevolg van fysiologische signalen
-Actief proces
-Schone dood: geen immuunrespons
Wat zijn de kenmerken van necrose?
-Gevolg van externe beschadiging zoals trauma, kou, toxine
-Veroorzaakt ontstekingsreactie en weefselschade
-Weefsel gaat plaatselijk dood, onomkeerbaar
Beschrijf het proces van apoptose
- Cel krimpt, verlies cel-cel contact, chromatinecondensatie
- Nucleus en organellen krimpen
- Fragmentatie: valt uit elkaar in apoptotische bodies. Alles blijft intact binnen de celmembraan
- Opgeruimd door fagocytose
Beschrijf het proces van necrose
- Cel zwelt en barst open
- Celinhoud komt buiten de cel en wordt herkend door het immuunsysteem-> inflammatiereactie
Wat zijn de verschillen tussen necrose en apoptose?
Apoptose: fagocytose dode cel
Necrose: zwelling van de cel, barsten van de cel
Allebei: DNA afbraak
Bij welke processen speelt apoptose een rol?
- Embryogenese
- Afstoten epitheelcellen (darm, huid)
- Verwijderen auto-reactieve T cellen
- Celdood in tumoren
- Celdood na DNA schade of cellulaire “stress”
Wat is het mechanisme van apoptose?
- Signaal: intrinsiek (cellulaire stress/ DNA schade) of extrinsiek (TNF, FASL)
- Controle en integratie: via mitochondriele permeabiliteit of via receptor (TNF, FASL)
- Uitvoering: caspase (afbraak cellulaire eiwitten) activering (2 mechanismen), DNAse activering (DNA afbraak)
- Fagocytose
Welke apoptose pathways zijn er?
Intrinsieke en extrinsieke pathways. Leiden allebei tot activering caspases (proteases)
Welke eiwitten zijn betrokken bij de intrinsieke apoptose pathway?
- Bcl-2 remt apoptose, BAX induceert apoptose. De relatieve concentraties bepalen of een cel dood gaat
- Bcl-2 en BAX doen hun werk aan de mitochondriele membraan
- Door het vormen van poriën in de mitochondriele
buitenmembraan wordt cytochroom c vrijgemaakt wat leidt tot de initiatie van de caspase cascade
Beschrijf het mechanisme van de intrinsieke apoptose pathway
- Binding survival signaal (bv GF)-> meer productie BCL2-> zorgt ervoor dat cytochroom C niet vrijkomt
- Bij onherstelbare DNA schade gaat BCL2 omlaag, BAX kanalen gaan open waardoor cytochroom C in het cytoplasma vrijkomt-> activering caspases, apoptose
Hoe wordt apoptose in kankercellen verstoord?
Apoptose wordt vaak geremd in kankercellen:
* Veranderingen in componenten van het apoptose proces worden in
veel tumoren gevonden. BCL2 verhoogd waardoor cel niet in apoptose gaat
* Deze veranderingen leiden tot een toename van het aantal tumorcellen
Wat veroorzaakt senescence?
Cellulaire “stress”
- tekort aan groeifactoren
- DNA schade door ioniserende straling of chemotherapie
- telomeer ‘erosie’
- oncogene stimuli
- etc.
Wat zijn de kenmerken van senescente cellen?
- Onomkeerbaar in de G0 fase van de celcyclus, kunnen niet meer delen
- Veranderen van celmorfologie (cellen worden platter en groter)
- Expresseren van celcyclus remmende eiwitten (p53, p21, p16 etc.)
- Produceren SASP (Senescence-Associated Secretory Phenotype) factoren:
uitgescheiden eiwitten zoals cytokinen, groei factoren, enzymen, etc. - SASP factoren veroorzaken ontstekingen
Wat zijn de effecten van SASP?
- Weefsel homeostase: omliggende cellen gaan delen
- Tumor suppressie (vanwege cytokine die immuunsysteem erbij roept). Senescente cellen worden verwijderd door het immuunsysteem
- Paracriene senescence: cellen rond senescent cel worden ook senescent
Wat zijn de negatieve effecten van senescence?
Als je ouder wordt wordt je immuunsysteem minder sterk waardoor senescente cellen minder worden opgeruimd-> kan leiden tot kanker en inflammatie. Tumorprogressie door de groeifactoren die de groei van de tumor promoten
Waarbij speelt senescence een rol?
Positief:
* Embryogenese
* Beperken van weefselschade
* Beschermen tegen het ontstaan van kanker
Negatief:
* Weefselveroudering
* Tumorprogressie
Wat zijn de kenmerken van het TP53 tumorsuppressorgen?
- “Guardian of the genome”
- TP53 meest gemuteerde tumorsuppressorgen
- Rol p53 in apoptose en senescence
- Werking p53 als transcriptiefactor
- Activering van p53
- Moleculaire circuits en kanker
Hoe wordt TP53 geactiveerd?
Door o.a. DNA schade met als mogelijk gevolg apoptose of senescence
Wat is de rol van TP53 bij kanker?
Is gemuteerd in meer dan 70% van alle tumoren bij de mens
* Mamma
* Long
* Huid
* Colon
* Blaas
* Vele andere …….
Wat voor eiwit is p53?
p53 tetrameer is een transcriptiefactor: kan in viertal binden aan promotor waardoor expressie van targetgen wordt geactiveerd
Uit welke domeinen bestaat p53?
DNA bindend domein, tetramiserisatie domein (C-terminaal), transcriptie activerend domein (TAD, N-terminaal)
Hoe verloopt de p53 signaalcascade in normale condities?
- MDM2 (negatieve regulator p53) bindt aan p53 eiwit. P53/MDM2 van nucleus naar cytoplasma
- Ubiquitine bindt aan p53-> signaal dat p53 eiwit wordt afgebroken door proteasomen
- Lage concentratie van p53-> geen p53 gereguleerde transcriptie
Hoe verloopt de p53 signaalcascade bij cellulaire stress?
- Onder cellulaire stress fosforylering van p53 waardoor het gestabiliseerd wordt: MDM2 kan er niet meer aan binden
- Hoge concentratie p53-> p53 in de nucleus
- Tetramerisatie en transcriptie
- Transcriptie geeft apoptose of senescence
Wat doet p53?
- p53 geeft eerst expressie van p21-> remming celcyclus zodat de cel de kans heeft om DNA schade te herstellen.
- Als dat niet kan activering BAX-> apoptose.
- p53 gaat op gegeven moment ook MDM2 activeren-> afbraak p53
Welke TP53 mutaties komen voor bij kanker?
- Grote deleties
- Verkorte eiwitten (nonsense, frameshift, splicing)
- Missense mutaties (75%)
Wat is het effect van een missense mutatie in p53?
- Structuur van het eiwit verandert
- Bindt niet meer aan DNA
- Geen p53 gereguleerde transcriptie
- Geen apoptose
Waar in p53 komen de meeste mutaties voor?
In het DNA bindend domein
Hoe kan p53 geinactiveerd worden?
- Verlies van beide allelen: geen p53 productie
- Missense mutaties: mutant p53 eiwit kan niet binden aan promotor. Dominant negatieve werking: als van de tetrameer gemuteerd is is binding al niet mogelijk
- MDM2 amplificatie: p53 eiwit afgebroken door proteasomen
Wat is het verschil tussen een tumorsuppressorgen en oncogen?
Tumorsuppressorgen: meestal moeten beide allelen gemuteerd zijn.
Oncogen: 1 gemuteerd allel is genoeg om kankercel te worden
Welk dier wordt het meest voor proefdieronderzoek gebruikt in waarom?
De muis:
* Overlap van 97% genen
* Veel genetische defecten bij de mens die ervoor zorgen dat een bepaald eiwit niet of verkeerd wordt aangemaakt, veroorzaken bij de muis identieke problemen
* Kan gemakkelijk genetisch gemanipuleerd worden
* Eenvoudig te huisvesten en plant zich snel en makkelijk voort
Waarvoor worden proefdieren in het kankeronderzoek gebruikt?
1- Preklinisch onderzoek:
Testen van nieuwe drugs/combinatie van drugs
2- Tumor biologie:
Opbouw van algemene kennis met genetisch gemodificeerde muizen
Wat voor preklinisch onderzoek wordt bij proefdieren gebruikt?
Patient-Derived Tumor Xenografts (PDTX):
* Inspuiten van verse tumorbiopten in een immunologisch verzwakte
muis (nude muis).
* Natuurlijke plaats of ‘ectopisch’.
* Tumordragend dier behandelen met een (combinatie van) geneesmiddel(en).
* Tumorgedrag: groei, regressie, relapse, resistentie.
Waardevolle modellen in het ontwikkelen van medicijn. Na testen clinical fase 1-3
Hoe wordt genoeg tumormateriaal verkregen voor PDTX?
Tumorbiopt groeit in muis-> materiaal voor andere muizen, zo test en controlegroep verkregen
Wat zijn de nadelen van PDTX?
- Werkt niet voor alle soorten tumoren
- Mist de anti- en pro-tumor activiteit van een functioneel immuunsysteem
Welke soorten genetisch gemodificeerde muizen zijn er?
A: dominante kankergen (oncogen) toevoegen, normaal en mutant genen actief (transgene muis)
B: gen uitschakelen, geen actief gen aanwezig (knock-out muis)
C: gen vervangen of muteren, alleen mutant gen aanwezig (knock-in muis)
Wat is het doel van onderzoek aan een transgene muis?
Onderzoek naar het effect van dominant negatieve mutaties (oncogenen)(Oncomuis)
Wat is het doel van onderzoek aan een knock-out muis?
Oderzoek naar het effect van gendeleties (tumorsuppressor genen)
Wat is het doel van onderzoek aan een knock-in muis?
Onderzoek naar het effect van puntmutaties
Hoe wordt een transgeen muismodel gemaakt?
- Gefertiliseerde eieren isoleren.
- Kort na fertilisatie DNA inspuiten in 1 van 2 pro-nucleis.
- Ei in foster moeder brengen.
- Op gegeven moment gaat DNA ergens in genoom integreren, geen controle over waar
Hoe wordt een KO/KI muismodel gemaakt?
- Embryonale stamcellen uit blastocyst (3,5 dagen na fertilisatie) isoleren. Dit zijn pluripotente cellen
- Cellen kweken.
- Daar mutatie/ modificatie in zetten, daarna terugzetten in blastocyst
- Blastocyst in foster moeder
Wat zijn de kenmerken van Brittle hair disorder trichothiodystrophy (TTD)?
Patiënten hebben een mutatie in XPD gen (betrokken bij NER)
* Breekbaar haar
* Voortijdige veroudering fenotype
Welke potentiele therapie wordt ontwikkeld voor brittle hair disorder trichothiodystrophy (TTD)?
Cel kan in apoptose of senescence-> senescent cellen zorgen voor veroudering. Senescent cel naar deling pushen zodat het toch voor apoptose kan gaan. p53 belangrijk bij apoptose, kan in senescent cel zijn werk niet doen omdat het gebonden is aan FOXO4. Peptide geven om FOXO4 binding te breken. Werkte in cel, daarna in XPD mutante muis getest-> ging veroudering tegen, potentie voor mensen
Welk wet bestaat er voor dierproeven?
Wet op de dierproeven (Wod) 1977:
In Nl zijn dierproeven verboden tenzij:
-Het doel van de proef anders niet kan worden bereikt (anders dan met deze dierproef (1977), met minder dieren/ongerief (1996))
-Het belang van de proef opweegt tegen het ongerief dat de proefdier wordt berokkend
-Er een vergunning is voor het verrichten van dierproeven
-Er goedkeuring is vanuit de Dierexperimentencommissie
Wat doet een Dierexperimentencommissie (DEC)?
-De ethische afweging van het belang van de proef enerzijds tegen het ongerief bij het dier anderzijds
-Toetsen of er sprake is van een (onaanvaardbare) schending van de intrinsieke waarde van het proefdier
-Beoordeelt de proefdierkundige/methodologische opzet van het experiment
Wat is de intrinsieke waarde van het proefdier?
De waarde die het dier in zichzelf heeft. Integriteit is heelheid, je mag niet zomaar de lichamelijke integriteit van het dier schenden
Hoe toetst een dierexperimentencommissie de opzet van een experiment?
Burch & Russell 1959, The principles of humane experimental technique:
-Replacement: vervanging
-Reduction: vermindering
-Refinement: verfijning (minder belasting)
Hoeveel dierproeven worden in Nl uitgevoerd?
-Afname proefdiergebruik sinds eind jaren 70
-600.000 in Nl per jaar
-50% muizen, 25% ratten
-15% GGO
-80-85% gering/matig ongerief
Welke verboden op dierproeven zijn er?
-Va 2002: verbod met mensapen
-11 sep 2004: verbod t.b.v. cosmetica
Wat zijn de 5 vrijheden van Brambell?
Dieren hebben het recht:
1. Vrij te zijn van dorst en honger
2. Vrij te zijn van fysiek ongerief
3. Vrij te zijn van pijn, verwondingen en ziekten
4. Vrij te zijn van angst en stress
5. Vrij te zijn om hun natuurlijke gedrag te vertonen
Wat was fase 1 van de ideeëngeschiedenis van dieren?
-T/m 17e eeuw werd gedacht dat dieren geen geest hadden, onderdeel materiele wereld, automaten
-Joods-Christelijke traditie t/m Descartes
-Mens als hoogtepunt van de schepping
Wat was fase 2 van de ideeëngeschiedenis van dieren?
-Kant geloofde datwreedheid jegens dieren slecht is voor de menslijke moraal (18e eeuw)
-Deontologie (plichtenleer): mensen hebben alleen directe plichten jegens andere rationele wezens, niet dieren (antropocentrisch)
Wat was fase 3 van de ideeëngeschiedenis van dieren?
-Bentham stelde vraag kunnen dieren lijden?
-Plichten naar dieren-> dierenwelzijnsbeweging va 1800 vanuit Engeland
-Consequentalisme (maximaliseren van het goede): het geluk of het ongeluk van dieren telt ook mee (biocentrisch)
Wat waren de ideeën van Singer (1975) over dieren?
Speciecism: speciecists stellen de behoeften van hun eigen soort boven die van andere soorten
Wat waren de ideeën van Nussbaum (2006) over dieren?
Capabilities approach: natuur streeft naar bepaald doel. Ook dieren willen floreren om beste versie zichzelf worden. Daarvoor dingen nodig die we aan dieren moeten geven
Welke mutatie wordt veel gevonden bij mensen met CML die resistent zijn geworden?
T315I in ABL1: ACT is naar ATT gegaan waardoor nu i.p.v. een threonine een isoleucine wordt ingebouwd
Wat is het probleem van een T3I5I mutatie?
Hij is resistent voor bijna alle inhibitors. Alleen ponatinib heeft geen last van deze mutatie
Wat zijn de kenmerken van Sanger sequencing?
● >500 bp DNA fragmenten
● Beperkt aantal samples
● Kleine DNA regios
● Relatief goedkoop en simpel
Wat zijn de kenmerken van NGS?
● <200 bp DNA fragmenten
● Groot aantal samples / diep sequencen
● Compleet genoom
● Goedkoper voor veel samples / grote DNA regios
Hoe fragmenteer je DNA bij NGS?
-Hoog energetisch geluid
-Restrictie enzymen
Niet mogelijk om complete DNA in 1 keer te sequencen
Uit welke delen bestaan adapters?
● P5 adapters: 3 end voor binden aan flowcell
● P7 adapters: 5 end voor binden aan flowcell
● Index: Unieke sequentie per sample
● Sequencing Primer 1: Basis voor uitlezen DNA fragment
● Sequencing Primer 2: Basis voor uitlezen DNA fragment
Wat doe je in cycle 1 van sequencing bij NGS?
- Voeg losse nucleotide met fluorescent-tags, primers en DNA
polymerase toe aan flowcell. Tag blokkeert binding volgende nucleotide - Exciteer fluorescent-tag met laser
- Maak snapshot van fluorescent-tag
Wat doe je na cycle 1 van sequencing bij NGS?
Cycle 2
1. Spoel fluorescent-tag weg en voeg nieuwe fluorescent-tagged nucleotide toe
2. Exciteer fluorescent-tag met laser
3. Maak snapshot van fluorescent-tag
Cycle n
1. Herhaal tot gewenste lengte is bereikt
2. Eventueel opnieuw bridge amplificatie en sequencen vanaf andere kant
Wat zijn de stippen op de flowcel bij NGS?
Elke gekleurde stip is een cluster van DNA fragmenten met identieke nucleotidenvolgorde
Hoe wordt de NGS data geinterpreteerd?
Sequentie DNA fragmenten (reads) worden opgeslagen in FASTQ bestanden. Deze staan in willekeurige volgorde.
Alignment tegen referentie genoom: BAM (Binary Alignment Mapping). BAM uitlezen in IGV (integrative genomic viewer)
Wanneer spreken we van een sequencing fout in IGV?
Wanneer afwijking t.o.v. referentie in maar 1 of enkele reads zit
Wanneer is een nucleotide verandering in IGV geen mutatie en wanneer wel?
Geen: afwijking in zowel controle als tumorsamplke
Wel: afwijking alleen in tumorsample
Hoe worden inserties in IGV afgebeeld?
(Korte) sequenties die niet voorkomen in referentie. Paars met nummer van hoeveel nucleotiden
Hoe worden deleties in IGV afgebeeld?
(Korte) sequenties die niet voorkomen in de reads, maar wel in de referentie. Streep met hoeveel nucleotiden
Welke mutaties zijn van prognostische betekenis bij AML met een normaal karyotype (zonder chromosoomafwijkingen gecorreleerd met afwijkende prognose)?
NPM1 en FLT3-ITD
Welke NPM1 mutatie in AML cellen wordt vaak gevonden?
Een insertie van TCTG (frameshift mutatie)
Wat voor mutatie is FLT3-ITD (AML)?
Interne tandem duplicatie (ITD): insertie van 45 basen. Er is geen frameshift omdat je het kan delen door 3
Wat zijn de consequenties van FLT3-ITD voor signaalfunctie?
FLT3 ID in JM domein veroorzaakt spontane activering van de FLT3 receptor (eiwit)-> spontane celdeling van AML cellen
Wat is het verband tussen type mutatie en prognose bij AML?
NPM1: betere prognose
FLT3-ITD: slechtere prognose
Hoe behandel je AML patienten met een slechte prognose door mutatie?
Deze geef je sneller een allogene transplantatie
Welke mutaties komen voor bij MPN?
PV: vooral JAK2
ET: >60% JAK2, CALR (calreticuline), MPL (receptor)
PMF: >50% JAK2, CALR, MPL
Wat gebeurt er bij essentiele trombocytose?
Er is spontane activering van de trombopoietine receptor (TPO-R/ MPL) door MPL en calreticuline mutaties-> spontane signaaltransductie
Wat veroorzaken calreticuline mutaties?
Spontane MPL dimeervorming in het ER
Welke mutatie zorgt voor continu actief JAK2?
GTC->TTC, valine (V617) wordt fenylalanine (V617F)
Welke mutatie zorgt voor continu actief MPL receptor?
W515L: TGG->TTG, tryptofaan wordt leucine
Wat is de bekende marker voor CNL patienten?
CSF3R. Deze vind je alleen bij CNL
Wat is het gevolg van een CSF3R mutatie?
Spontane dimeervorming waardoor de JAKs actief zijn zonder G-CSF binding-> promoot granulocyten vorming. Het is dus G-CSF onafhankelijke proliferatie
Wat zie je bij CNL?
Veel uitgerijpte granulocyten
Wat voor mutatie is een CSF3R mutatie?
T618l: ACC->ATC, threonine wordt isoleucine
Kan het immuunsysteem kanker herkennen?
Afwijkende eiwitten tgv mutaties op kankercel kunnen wel door het immuunsysteem herkend worden. Gebeurt in sommige vallen, maar gebeurt ook vaak niet
Wat is de anti-tumor immuunrespons?
Tumor antigenen opgenomen door antigeen-presenterende cellen die migreren en Ag presenteren aan CD8+ cytotoxische T-cellen die de tumorcel kunnen vernietigen (cytotoxie)
Beschrijf het mechanisme van immuunherkenning van tumorcellen
HLA op alle lichaamscellen (ook tumorcel)
1. HLA presenteert Ag aan TcR-> activatie CD8+
2. Cytotoxische granulen: perforine perforeert de tumorcel, granzym B gaat cel in waardoor tumorcel in apoptose gaat
Wat zijn de problemen met het immuunrespons tegen kanker?
- Tumoromgeving is vaak immuun-suppressief
- Tumoren zijn weinig immunogeen: tolerantie, geselecteerd voor survival
Waardoor is de tumoromgeving vaak immuun-suppressief?
- cytokines: o.a. TGF-, IL-10
- andere mediatoren: o.a. IDO, adenosine
- immuun-regulerende (=-suppressieve) cellen:
- M2 macrofagen
- regulatoire T cellen (Treg)
- myeloid-derived suppressor cells (MDSC)
Wat is cancer immune editing?
Editing van kankercellen met als doel aanvallen door het immuunsysteem te ontwijken
Welk evenwicht is er tussen kankercellen en het immuunsysteem?
- Getransformeerde cellen brengen bepaalde moleculen tot expressie die door het immuunsysteem opgevangen worden-> immuunsysteem ruimt getransformeerde cellen op
- In de praktijk ontstaat vaak balans tussen getransformeerde cellen en immuunsysteem wat hoeveelheid getransformeerde cellen in ew houdt. Additionele mutaties, als mutatie survival effect heeft kan equilibrium doorbroken worden en ontsnappen cellen aan immuunsysteem. bv MHC (Ag presenterende receptoren) downregulatie
Wat zijn de stappen van een effectieve T-celrespons tegen kanker?
- Tumor specifieke antigenen komen vrij uit tumormassa (bv als cellen afsterven)
- Ag opgenomen door dendritische cellen/ APCs, verhuizen naar de drainerende lymfklieren
- Daar priming: DC presenteert Ag aan T-cellen-> activatie T-cellen, proliferatie
- Cytotoxische T-cellen verhuizen via bloedbaan en komen bij tumor. Chemokines en chemokinereceptoren bepalen dat T-cellen op dezelfde plek komen
- Infiltratie van T-cellen in tumor
- Herkenning van kankercellen door T-cellen-> activatie T-cel
- Cytotoxische T-cel doodt de tumorcel
Wat is immunotherapie?
Richt zich op de manipulatie/ activatie van het eigen immuunsysteem waardoor deze behandeling de tumor via een indirecte weg aanvalt. Het stimuleert het immuunsysteem zodat dit op een krachtige weijze de kankercellen kan herkennen en vernietigen
Hoe verloopt Ag-presentatie in de lymfklier?
-Signaal 1 (APC presenteert Ag) voor activatie
-Co-stimulatie nodig voor volledige activatie T-cel. CD80/CD96 opAPC bindt CD28 op T-cel
Hoe wordt Ag-presentatie in de lymfklier gereguleerd?
Regulatie: geactiveerde T-cel produceert CTLA-4 dat hoge affiniteit heeft voor CD80/CD86-> immuunrespons afgeremd. CTLA4 is een checkpoint remmer
Hoe kunnen we het immuunsysteem actiever maken?
Checkpoint inhibitors blokkeren (rem loslaten). Deze medicijnen zijn antilichamen die specifiek een target kunnen binden (biologicals)
Hoe kunnen tumorcellen het immuunsysteem remmen?
Als tumorcel met ligand in staat is checkpoint te activeren wordt de T-cel geinactiveerd
Wat is de relatie tussen aantal mutaties in een tumor en afweerrespons?
Tumoren met veel mutaties stimuleren meer afweerrespons. Veel mutaties-> veel neo-Ag-> gevoelig voor immuuncheckpoint remmers (ICI)
Wat zijn CAR-T cellen?
T-cellen uit lichaam gehaald en zodanig gemodificeerd dat ze de tumorcellen herkennen, weer in lichaam gebracht
Welke ICI’s zijn er nu?
Immunotherapie gericht op CTLA-4 en PD-1/PDL-1 interactie. Nog veel meer interacties tussen kankercellen en T-cellen, daar minder succes mee
Wat zijn de kenmerken van ICI’s?
- Mab dus IV; mono- of combinaties met elkaar/ chemo/ angiogeneseremmers
- Lange halfwaardetijd (>20 dagen), 3-6 wekelijks geven
- Verplaatsing toediening bij eind stadium tot eerder in behandeling
-Palliatief, adjuvant, neoadjuvant, inductie - Onduidelijke dosis-effect en dosis-toxiciteit relaties
Kunnen CTLA-4 en PD (L)-1 blokkade gecombineerd worden?
Bij combi CTL4 en PD as aanpakken sterkere effect, ook meer bijwerkingen
Wat voor tumoren reageren goed op immunotherapie?
-Bij hoge PD-1/PDL-1 gehalte expressie op tumor doet immunotherapie het beter: >50% expressie. <50% expressie geen verschil in effectiviteit
-MSI HIGH tumoren reageren erg goed (Lynch!)
-CTLA-4 remming beperkter inzetbaar
Wat zijn bijwerkingen van immunotherapie?
Bijwerkingen immuunstimulatie: kan niet altijd goed target onderscheiden. Auto-immuunziekte soms bijwerking immunotherapie. Immuniteit weer remmen met prednison
Waarvan is de werkzaamheid van ICIs afhankelijk?
-Mutatiefrequentie van tumoren (neo-Ag)
-Tumorinfiltraat van leukocyten
-Expressie van PD-L1
-MSI status
