Week 3 Flashcards
Wat is de slaap-waak ritme van de mens?
Interne klok met omlooptijd van 25 uur: circadiane klok (circa diem)
Wordt dagelijks gelijk gezet door licht
Wat is de phase-response curve (PRC)?
Geeft phase shift weer:
-Phase delay: bij lichtpuls aan begin nacht bij muis
-Phase advance: bij lichtpuls aan eind nacht
Photoentrainment
Wat is het effect van licht op de circadiane klok?
Licht zet de klok dagelijks gelijk
-Fotoreceptoren melanopsine in subset ganglioncellen-> belangrijkste fotoreceptor voor resetten klok, circadiane fotoreceptor, vn respons op blauw licht.
-Opsines in staafjes en kegeltjes spelen ook een rol.
Waar wordt de interne klok gereguleerd?
SupraChiasmatische Nucleus (SCN) in anterior hypothalamus net boven opticus chiasmus. Slaap- en temperatuurritmiek die elke dag hetzelfde zijn.
Wat gebeurt er bij beschadiging van de SCN?
Bij beschadiging SCN verdwijnt het ritmisch gedrag. Activiteit, slaap en temperatuur worden aritmisch.
Wat zijn de essentiële klokgenen?
Cry 1 en 2 (homologe genen):
-Bij uitschakelen Cry1 wordt ritme elke dag eerder: klok wordt sneller
-Bij uitschakelen cry2 wordt omlooptijd langer
-Bij uitschakelen allebei wordt klok aritmisch
Hoe worden de klokgenen geactiveerd?
Clock en Bmal1 zijn klokgenen. Ze activeren de transcriptie van de Cry1-2 en Per1-2 genen via E box
Wat is de negatieve loop van klokgen regulatie?
Core loop:
Cyclische remming CLOCK/BMAL1 door CRY/PER complex (eiwitten)
Wat is de positieve loop van klokgen regulatie?
Stabiliserende loop:
Cyclische activatie Bmal1 door REV-ERBα
Wat is het moleculair mechanisme van de circadiane klok?
Een moleculair raderwerkje van
klokgenen en klokeiwitten
die elkaar periodiek aan- en uitschakelen en zo een oscillatie in transcriptie genereren van ongeveer 24 uur
Waardoor bestaat er variatie in chronotypen?
Posttranslationele modificatie (fosforylatie, ubiculatie en acyetylatie) bepalen stabiliteit PER en CRY-> timing ophoping kern-> omlooptijd klok (Tau). Kloksnelheid bepaalt chronotype (ochtend of avondmens)
Waaraan wordt de moleculaire klok gekoppeld en hoe?
Klokgestuurde output genen (CCGs) koppelen moleculaire klok aan gedrag, fysiologie en metabolisme
Wat zijn de kenmerken van de centrale klok?
- In de neuronen van de SCN
- Iedere dag gelijk gezet met
licht-donker cyclus door licht via retinal hypothalamic tract
Wat zijn de kenmerken van de perifere klokken?
- Overige (zenuw)weefsels en cellen. Iedere cel in lichaam heeft een klok
- Ongevoelig voor lichtprikkels
- Iedere dag gelijk gezet door de SCN via humorale factoren (bijv. hormonen) en neurale stimuli
- Zelfde set klokgenen als SCN
Hoe wordt voor synchronisatie van cellen in celkweken gezorgd?
SCN cellen in kweek synchroon, perifere cellen in kweek lopen uit fase met elkaar (alles bij elkaar flatline). Synchronisatie door serum, peptide hormonen, steroiden of glucocorticoiden.
Hoeveel van de genen staan onder circadiane controle?
- I20 % van alle actieve genen
- Piek activiteit op verschillende momenten van de dag
Wat is het nut van de circadiane klok?
De circadiane klok:
- stelt onze lichaamsfuncties in staat te anticiperen op de specifieke behoefte op bepaalde momenten van de dag
- geeft tijdstructuur aan onze cellen en organen
- is evolutionair geconserveerd, in bijna alle organismen aanwezig
Wat is circadiane desynchronie?
Verschil lichaamstijd en geografische tijd
Wat zijn de gevolgen van circadiane desynchronie?
Acute klachten (tijdelijk):
-Slaaptekort
-Verminderde alertheid
-Vermoeidheid
-Verminderd prestatievermogen
Lange termijn:
-Cardiovasculaire ziekten
-Metabole aandoeningen
-Kanker
Wat is chronofarmacokinetiek?
Absorptie, distributie, metabolisme en eliminatie hebben op verschillende momenten verschillende mate van effectiviteit. Zo heeft Tamoxifen bij inname ‘s ochtends hogere effectieve dosis in bloed aanwezig dan bij inname ‘s avonds
Wat is chronotoxiciteit?
Toxisch effect is afhankelijk van het tijdstip van blootstelling. Blootstelling van cyclofosfamide geeft overdag een veel hogere activatie/ verandering van genexpressie dan ‘s nachts. Muizen die er overdag mee behandeld worden overleven, ‘s nachts gaan ze dood
Wat is de correlatie tussen de celcyclus en de circadiane klok?
Cellen vermenigvuldigen DNA en delen op vast moment van de dag, koppeling circadiane klok en celcylcus
-Koppeling bidirectioneel: resetting klok door celcyclus
Hoe kan chronotherapie bij kanker worden toegepast?
Veel chemotherapeutica werken op delende cellen (vaak S-fase)
- gezonde cellen-> bijwerkingen
- tumorcellen zijn ontkoppeld-> asynchroon. Chemo op moment meeste effect op kankercellen en niet op gewone cellen-> minder bijwerkingen
Wat is de checklist voor potentioneel chronotherapeutische geneesmiddelen?
- Vertonen de symptomen van een ziekte significante circadiane variatie?
- Is de farmacokinetiek van het geneesmiddel afhankelijk van het tijdstip van toediening?
- Vertoont het target orgaan circadiane variatie in de gevoeligheid voor het geneesmiddel (effectiviteit, toxiciteit)?
Wat is chronofitness en waarmee is het geassocieerd?
Robuustheid circadiane ritmiek (chronofitness) geassocieerd met een hogere kans overleving
Lifestyle verandering (slaapgedrag, sport, ploegendienstarbeid), coaching
Waaruit bestaat het chromosoom?
DNA, histonen en andere eiwitten
DNA: genen (2%), centromeer, telomeren
Hoe is het DNA gepakt?
Elke cel bevat ongeveer twee meter DNA, ingepakt in een kern van ongeveer
10 micrometer doorsnede
Uit welke fasen bestaat de celcyclus?
G1: celgroei
S: verdubbeling van het DNA
G2: klaarmaken voor mitose
M: uitverdeling van de
chromosomen over de dochtercellen
Uit welke fasen bestaat de mitose?
Profase: condensering chromosomen
Prometafase: kernenvelop lost op
Metafase: chromosomen middenin cel in de metafase plaat
Anafase: chromosomen uit elkaar getrokken
Telofase: DNA ontwonden, kern teruggevormd
Cytokinese: insnoering tot 2 afzonderlijke cellen
Hoe worden de chromosomen bij mitose uit elkaar getrokken?
-De centrosoom wordt verdubbeld in de S-fase
-In de mitose gaan beide centrosomen uit elkaar
-Spoeldraden komen uit het centrosoom en worden aan het chromosoom
vastgemaakt (kinetochoor)
-Als alles vast zit begint de anafase
Welke technieken worden gebruikt om chromosomen zichtbaar te maken?
Alle chromosomen aankleuren (bijv. R bandering)
In situ hybridisatie (FISH) (naar specifiek gen kijken)
Chromosoom specifieke probes (FISH)
Welke structurele chromosomale afwijkingen zijn er?
- Deleties
- Translocaties
- Dicentrische chromosomen
Hoe ontstaan structurele chromosomale afwijkingen?
Start altijd met een DNA dubbelstrengs breuk (in hele cyclus)
-Deletie als helemaal niet meer gerepareerd
-Translocatie als verkeerd aan elkaar gezet
-Dicentrische chromosoom als aan 1 chromosoom 2 centromeren komen en de ander acentrisch is
Wat gebeurt er met een dicentrisch chromosoom?
-Chromosomen worden in de metafase uit elkaar getrokken
-Dit gaat in 50% gevallen fout bij dicentrische chromosomen. Omgekeerd vast-> 2 kanten op getrokken-> chromosomale instabiliteit-> breuk, dan translocaties of deleties
-Dicentrisch dus alleen direct na bv bestraling zichtbaar
Welke numerieke chromosomale afwijkingen zijn er?
-Chromosoomverlies
-Chromosoomduplicatie
Hoe ontstaan numerieke afwijkingen?
-In de metafase worden alle chromosomen vastgemaakt
-Als een chromosoom niet vast zit voordat de uitverdeling
begint, dan kan er een
chromosoom te veel of te weinig in de dochtercel komen
(non-disjunctie). 2 paar chromosomen dus 1 in de ene cel en 3 in de andere
Hoe ontdek je numerieke afwijkingen?
- In het karyogram (bij leukemie, bij veel andere tumoren niet mogelijk)
- Analyse van (CA)n repeats (polymorfe gebueden DNA), unieke variant per chromosoom, als maar 1 chromosoom vind je maar 1 unieke CA repeat
- Bij NGS: verlies van Single Nucleotide Polymorphisms. Plekken in DNA waarbij vader en moeder verschillende DNA sequenties hebben
Hoe ontstaat een deletie?
- Dubbelstrengs breuk in DNA
- Mitose
- Het stukje chromosoom zonder centromeer wordt niet goed, buiten kern als nieuwe kernmembraan wordt gevormd
uitverdeeld - Om stukje chromosoom microkern gevormd. Wordt niet goed gerepliceerd of bijgehouden, gaat meestal verloren
Wat is chromothripsis?
- Chromosoom breekt in kleine stukjes en wordt min of meer willekeurig aan elkaar gezet
- 1 of meerdere chromosomen
Wat is genamplicatie?
-Het hele chromosoom moet precies 1x per celcyclus verdubbeld worden
-Als dat niet gebeurt, komen er meerdere kopieën van een deel van het chromosoom (1 of enkele genen)
-Dit kun je zien als homogeen kleurende
gebieden of ‘dubbel minute’ chromosomen (buiten chromosoom)
Welke chromosomale afwijkingen kunnen oncogenen activeren?
-Translocatie
-Verdubbeling van chromosoom
-Genamplificatie
Welke chromosomale afwijkingen kunnen tumor suppressor genen inactiveren?
-Deletie
-Verlies van chromosoom
Hoe worden telomeren beschermd?
T-loop met stabiliserende eiwitten, soort op elkaar teruggevouwen zodat ‘breuk’ niet ergens aan vastgeplakt wordt door NHEJ
Wat zijn de gevolgen als telomeren niet beschermd worden?
Uiteinde ergens aan gekoppeld door NHEJ-> dicentrisch chromosoom-> instabiel, leidt tot breuken enz.
Waardoor kunnen normale cellen niet onbeperkt delen?
Cellen kunnen beperkt aantal keren delen doordat telomeren bij elke deling korter worden, bij bepaalde lengte signaal om niet meer door te delen. Anti-tumor mechanisme. Als signaal wordt uitgezet verder doordelen, begint sequentie te verliezen dat belangrijk is en cel gaat dood
Waardoor kunnen tumorcellen wel onbeperkt delen?
85-90% van alle tumoren brengt telomerase tot expressie
Niet 100% omdat er ook nog andere mechanismen zijn om telomeren te
verlengen: ALT
Welke kankertherapie grijpt in op telomerases?
Telomeraseremmers zouden tumorgroei kunnen remmen
Kan mutatie in telomerase krijgen waardoor remmers niet meer goed werken
Wat zijn de fasen van de celcyclus?
G1: fysieke groei van de cel, restrictiepunt (besluit om replicatie te starten, point of no return)
S: duplicatie van de chromosomen
G2: voorbereiding op celdeling
M: celdeling
Wat zijn de genen van de celcyclus?
- Cyclines
- Cycline afhankelijke kinases (CDKs)
- Cycline afhankelijke kinase remmers (CKIs)
Welke cyclines zijn er?
-Cycline D
-Cycline E
-Cycline A
-Cycline B
Wat is de rol van cycline D?
Activatie van de celcylcus in G1 (na groeisignaal, signaal delen). Begint in G1, aanwezig tot mitose
Wat is de rol van cycline E?
Overgang naar en voortgang van S-fase, piek tijdens overgang
Wat is de rol van cycline A?
Progressie door S-fase, piek in G2
Wat is de rol van cycline B?
Overgang naar M-fase, piek in M
Wanneer zijn CDKs aanwezig?
Altijd onafhankelijk van de celcyclus fase
Wat zijn de kenmerken van CDKs?
- Continu aanwezig
- Alleen actief in complex met cyclines (fasering)
- Fosforyleren eiwitten nodig voor celcyclus progressie
Welke cycline-dependent kinases zijn er?
- CDK4: associeert met cycline D
- CDK2: vormt complex met cycline E en A
- (CDK 1 bindt aan cycline B)
Wat zijn de kenmerken van CDK inhibitors (CDKIs)?
- Binden aan Cyclin / CDK complexen
- Remmen kinase activiteit
- Voornamelijk in G1-fase of na signalen van buiten de cel of na DNA schade, geeft kans om DNA schade te herstellen
Welke CDKIs zijn er?
- Cycline D/ CDK4: CKI p16(ink4a)
- Cycline E/ CDK2: p21
Welke celcyclus checkpoints zijn er?
-Restrictie-punt
-G1/S
-Intra S
-G2/M
-Anafase
Wat controleert de restrictie-punt checkpoint en welke eiwit is daarbij betrokken?
Wel/ niet meer delen? Specialiseren? Als besloten om wel te delen kan het niet meer terug.
Eiwit: retinoblastoma (RB)
Wat controleert de G1/S checkpoint en welke eiwit is daarbij betrokken?
DNA schade?
p53
Wat controleert de intra S checkpoint en welke eiwit is daarbij betrokken?
DNA schade?
ATM
Wat controleert de G2/M checkpoint?
DNA schade? Replicatie volledig?
Wat controleert de anafasecheckpoint en welke eiwit is daarbij betrokken?
Chromosomen goed gerangschikt?
BUB1
Beschrijf de signaaltransductie voor celdeling
- Groeifactor
- Groeifactor-receptor (celmembraan)
- Doorgave signaal (cytoplasma-> kern)
- Activatie genen betrokken bij de celdeling
Welke signaaltransductie pad is er bij het restrictie-punt?
- EGF geeft signaal door via RAS
- Niveau cycline D gaat omhoog
- Cycline D/ CDK4 wordt actief. Geeft signaal dat cel kan delen
Wat is E2F?
- transcriptie factor
- reguleert expressie van genen nodig in de S fase
Wat is de rol van pRB bij het restrictie-punt?
E2F is inactief als gebonden aan pRB, in aanwezigheid van cyc D/ CDK4 wordt RB gefosforyleerd waardoor het loskomt, E2F is vrij om te binden aan de promotor waardoor specifieke genen tot expressie komen: cycline E (overgang naar S fase) + p16 (CKI) (remt cyc D/ CDK4)
Hoe verloopt de G1/S checkpoint bij DNA schade?
- Als een cel DNA schade heeft gaat de hoeveelheid p53 omhoog
- Transcriptiefactor, p21 wordt afgeschreven
- Remt cyc E/ CDK2
- G1/S arrest
Hoe verloopt de G1/S checkpoint bij DNA schade bij een mutant p53 cel?
- p53 komt niet tot expressie
- p21 wordt niet afgeschreven
- Cyc E/ CDK 2 niet geremd
- Replicatie beschadigd DNA, kan leiden tot een tumorcel
Wat is er aan de hand bij ataxia telangiectasia (AT) patienten?
Defecte ATM gen waardoor de intra S checkpoint niet goed werkt
* Overgevoelig voor Röntgen stralen
* Kanker predispositie
* Progressieve ataxia
Wat is de rol van ATM in een normale cel?
- ATM kinase fosforyleert CHK2 (activatie)
- CHK2 remt Cyc A/ CDK2
- Remming DNA synthese in S fase. Cel krijgt de kans om DNA schade te herstellen
Wat is het gevolg van defect ATM?
Cyc A/ CDK2 blijft actief.
Replicatie beschadigd DNA + mutaties
Radioresistente DNA synthese (RDS) fenotype: reageert niet meer op schade door straling
Hoe werkt een assay voor intra S checkpoint defect?
AT patient cel en controle cel in S fase. Voegt stoffen toe die deling stimuleren + radioactieve thymidine. Normale cel gaat replicatie niet verder als radioactief t ingebouwd wordt, weinig inbouw daarvan. Bij AT patient wel inbouw
Hoe werkt de anafase checkpoint?
Spanning-gevoelige eiwitcomplexen om te voelen of alle microtubuli goed verbonden zijn: MAD1 en BUB1. Als er spanning is signaal dat anafase kan plaatsvinden
Wat zijn de gevolgen van defecten in het anafase checkpoint?
Aneuploidie
Wat veroorzaakt het Nijmegen breuk syndroom (NBS)?
Nbs1 of RAD50 deficienties
Autosomaal recessief
Welke symptomen passen bij Nijmegen breuk syndroom?
- Microcefalie
- Groeiachterstand
- Intellectuele beperking
- Gonadal dysgenesis
- Immuun deficiëntie
- Chromosomale instabiliteit
- Stralings gevoeligheid
- Kanker predispositie
Beschrijf het mechanisme waarop DNA afwijkingen ontstaan bij Nijmegen breuk syndroom
RAD50 complex vormt een brug tussen gebroken DNA moleculen bij dubbelstrengs breuk. Als dit niet correct gebeurt kan dat leiden tot translocatie. RDS fenotype
Beschrijf het pad van RAD50/Nbs1
- RAD50/Nbs1 activeert ATM kinase
- ATM kinase activeert downstream substraten waaronder CHK2
- CHK2 deactiveert CycA/ CDK2
- DNA synthese wordt geremd
- DNA schade reparatie
Wat is de beste maat voor genexpressie?
De hoeveelheid eiwit
Welke mogelijkheden zijn er voor analyse van eiwit?
Eiwit-identificatie, -modificatie en -interactie
Beschrijf de techniek van eiwit identificatie met massa spectrometrie
- Eiwit of eiwitmengsel
- Trypsine digestie
- Analyse met massa spectrometrie
- Data vergelijking (Human Genome Project)
- Identificatie van het eiwit
Wat zijn mogelijke oorzaken van toegenomen witte bloedcellen in het bloed?
Normale reactie van het lichaam op bv.:
1. Infecties
2. Ontstekings processen
Leukemie
Welke symptomen passen bij CML?
Weinig symptomen, vergrote milt
Hoe kenmerkt het bloed zich bij CML?
Enorme toename leuko’s (in beenmerg verschuiving naar myeloide reeks), veel verschillende typen bloedcellen waaronder voorlopercellen
Baso 3%
– Eo 3%
– Neutro 40%
– Lymfo 3%
– Mono 1%
– Blasten 6%
– Promyelo 1%
– Myelo 15%
– Metamyelo 8%
– Staven 20% (functioneel)
Hoe wordt de diagnose CML gesteld?
-Bloedbeeld
-Verschuiving naar myeloide reeks in beenmerg
Verder onderzoek ter bevestiging van de diagnose:
* cytogenetisch onderzoek van beenmergcellen
* moleculair onderzoek voor BCR-ABL fusiegen
Hoeveel mutaties zijn nodig voor het ontstaan van myeloide leukemie?
AML: veel mutaties
CML: 1 mutatie met ernstige gevolgen
Hoe reageert een cel op DNA schade?
- Aanzetten van DNA herstel-mechanismen
- Incorrect DNA schade herstel: Cel gaat dood
- Incorrect DNA schade herstel/Cel gaat niet dood: Mutaties gevolgd door transformatie
Welke soorten DNA-schade zijn er?
- Waarneembaar met een microscoop: Chromosoom-afwijkingen
- Niet waarneembaar met een microscoop:
Punt-mutaties, micro-deleties, micro-inserties etc.
Welke DNA-afwijking komt vaak voor bij CML?
In 95% patienten t(9;22) translocatie: philadelphia chromosoom (22)
Hoe verlopen DNA-afwijkingen bij kanker?
Begint in 1 cel, krijgt groeivoordeel en neemt over-> normale beenmerg verdrongen
Waar vinden de DNA-breuken plaats bij t(9;22)
9: in gen ABL. 2 exonen, breuk in intron
22: in gen BCR. Bestaat uit 5 exonen, breuk in intron 2 of 3
Fusiegen BCR-ABL
Wat is het fusie-eiwit van BCR-ABL?
Een tyrosine kinase-> geeft signaal af waardoor cellen zich gaan vermenigvuldigen
Hoe wordt CML primair behandeld?
Met imatinib (=Gleevec):
1. Fusie-eiwit neemt ATP op in een pocket en gebruikt dit om een substraat-eiwit te fosforyleren-> signaal naar kern voor celdeling
2. Imatinib is een small molecule die exact in de pocket past-> geen ATP dus geen signaal
Hoe kan imatinib resistentie ontstaan?
Mutaties in het Abl1 gedeelte van het BCR/ABL fusie-eiwit zorgen ervoor dat imatinib niet meer in de pocket past
Hoe wordt CML behandeld bij imatinib resistentie?
- Imatinib alternatieven: dasatinib, nilotinib, ponatinib (T415I)
- Stamceltransplantatie als dat niet werkt
Wat is het beloop van CML als TKI niet werken?
Overgang naar acceleratie fase en blasten fase. Blastenfase is moeilijker te behandelen. Ontwikkelt tot AML, veel blasten in bloed, cellen differentieren zich niet meer
Wat is het beenmerg beeld bij AML?
Homogeen beeld van onrijpe cellen. Ery, bloedplaatje en normale leuko vorming verdrongen
Wat is het verloop van AML?
Gedraagt zich bij elke patient anders: sommigen genezen, sommigen binnen maand dood, sommigen remissie maar komt terug in hevigere vorm
Waardoor wordt de prognose van AML bepaald?
Gunstig: inv(16), t(15;17), t(8;21), reageert goed op chemo
Standaard
Ongunstig: monosomie 7, chemo + stamceltransplantatie
Hoeveel van de mutaties bij leukemie zijn met de microscoop zichtbaar?
Bij meer dan de helft van de gevallen zijn deze genetische veranderingen met een microscoop waarneembaar. Onder deze cytogenetische veranderingen vinden we vaak chromosoom translocaties, die karakteristiek zijn voor bepaalde leukemie typen
Welke bloedcellijn is vooral aangedaan bij CML?
De neutrofiele granulocytlijn
Wat is de beste maat voor genexpressie?
De hoeveelheid eiwit is een betere maat voor genexpressie dan mRNA
Welke mogelijkheden voor eiwitanalyse (proteomics) zijn er?
Eiwit-identificatie, -modificatie (bepaalt activiteit) en -interactie mapping
Hoe verloopt eiwitidentificatie met massaspectrometrie?
- Eiwit of eiwitmengsel
- Trypsine digestie
- Analyse met massa spectrometrie
- Massa’s vergelijken met massa’s menselijke proteoom (Human Genome Project)
- Aan de hand van de matches identificatie van het eiwit
Wat is trypsine digestie?
-Het darmenzym trypsine knipt de peptidebindingen van eiwitten op specifieke plaatsen: voor Arginine (R) en Lysine (K)
-Hoe groter de stukjes hoe moeilijker het is de massa van het eiwit te bepalen. Beste tryptische fragmenten van enkele tientallen aminozuren
Hoe verloopt analyse van eiwitten met massa spectrometrie?
-Elk peptide in sample krijgt een positieve lading
-MALDI-TOF: Sample plaat is + en stoot sample af. Gaat in gasfase richting negatieve plaat met gaatje, deel moleculen vliegt door gat en gaat door vacuumbuis.
-De snelheid waarmee stukje peptide beweegt afhankelijk van de massa (hoe kleiner de massa hoe sneller het beweegt en op de monitor komt). Monitor telt hoeveel deeltjes erop terechtkomen per tijdseenheid.
-Uit tijd de massa af te meten. Massa pieken exact gemeten tot cijfers achter de komma, daarmee achterhalen welke aminozuren erin zitten (nog niet volgorde)
Hoe worden de eiwitmassa’s vergeleken met het menselijk proteoom?
Computer berekent massa’s van alle mogelijke tryptische fragmenten van alle mogelijke eiwitten uit het database menselijk genoom. Massa’s vergelijken met spectrometrie massa’s
Waarvoor kan massa spectrometrie gebruikt worden?
Massa spectrometrie kan:
- eiwit identificeren
- eiwit kwantificeren (iets moeilijker)
- bindende eiwitten identificeren
- eiwitmodificaties identificeren (fosforylering, acetylering, methylering, etc.)
Hoe kan je met massa spectrometrie eiwit kwantificeren?
-Piek hoogte correleert met hoeveelheid eiwit
-Als je er een eiwit bijstopt waarvan je de hoeveelheid weet kun je kalibreren en precies meten hoeveel eiwit er is
Hoe kan je met massa spectrometrie bindende eiwitten identificeren?
- Immuunprecipitatie: Voeg antilichaam toe dat specifiek bindt aan eiwit van interesse. Andere kant antilichaam vastgemaakt aan iets dat onoplosbaar is (bv bolletje).
- Bolletjes eruit vissen. Je houdt alleen eiwitten over die vastzitten aan eiwit van interesse
- Identificeer bindende eiwitten via massa spectrometrie
Hoe kan je met massa spectrometrie eiwitmodificaties identificeren?
- Eiwitmengsel
- Trypsine digestie
- Evt. verrijk voor fosfopeptiden
- Identificeer mbv massa spectrometrie. Bv. peptide met fosfaatgroep is zwaarder (80 dalton). Kijken hoeveel peptide met fosfaatgroep en hoeveel zonder. Als bij bepaalde proteinkinase remmer fosfaatgroep piek niet meer gevonden conclusie dat eiwit door dat specifieke kinase gemodificeerd wordt.
Wat is transcriptomics?
Analyse hoeveelheid RNA
Wat is metabolomics?
Analyseert welke metabolieten voorkomen, bv. in het bloed (geproduceerd door eiwitten)
Hoe kan metabolomics bij kankeronderzoek gebruikt worden?
Tumor markers: verandering energiemetabolisme tumorcel geeft mogelijke verandering metabolieten in het bloed
Wat zijn de stappen van metabolomics?
- Sample preparation:
evt zuiveringsstap - Massa spectrometrie
- Identificatie metabolieten m.b.v.
computer - Herkennen van
patroon: samenstelling metabolieten specifiek voor iemand met een tumor - Wat is de biomarker?
Waarom is mRNA niet altijd voorspellend voor eiwit(activiteit)?
Translatie controle (meer of minder afgeschreven), eiwit degradatie of eiwit activiteit controle d.m.v. modificatie
Hoe wordt translatie geremd?
- MicroRNA gecodeerd in het DNA (dubbelstrengse loops)
- Op maat geknipt door Drosha (kern) en Dicer (cytoplasma)
- 1 streng in het RISC complex ingebouwd
- Bindt complementair aan 3’ uiteinde mRNA waardoor de translatie van mRNA daalt
Wat zijn de taken van de onderdelen van RISC?
miRNA zorgt voor specificiteit, eiwitcomponenten zorgen voor repressie van translatie of mRNA afbraak
Wat is het belang van microRNA voor kanker?
miR-16 bindt aan 2 verschillende mRNA’s. Bij verlaagde miR-16:
-Meer Bcl2-> apoptose geremd
-Meer Cdc25A-> celcyclus progressie
Dit zijn 2 kenmerken van een kankercel
Hoe kan microRNA geanalyseerd worden?
- miRNA microarrays kunnen de expressie van honderden miRs tegelijkertijd bepalen
- dit kan ook met ‘next generation’ sequencing
- dit kan net als bij mRNA expressieprofielen geanalyseerd worden
- goede diagnostische en prognostische waarde
Wat is siRNA?
Short interfering RNA: stukje RNA dat wij in de cel brengen. Ingebouwd in RISC-> mRNA of niet tot expressie of afgebroken (RNAi: RNA interferentie)
Hoe wordt siRNA gebruikt?
Vn tool voor onderzoeker:
1. siRNA voor veel genen, elk in een aparte celkweek
2. In elke celkweek is nu 1 gen uitgeschakeld
3. Analyseer het effect van deze behandeling
4. Kijk welke siRNA’s celdood geven voor kankercellen, maar niet voor normale cellen
5. Controleer dan of er al remmers voor deze targets aanwezig zijn
6. Controleer of die remmer inderdaad werkt in cellen en diermodellen
Uit welke componenten bestaat het humane genoom?
Mitochondriaal en kern DNA
22 autosomen en 2 geslachtschromosomen
Hoeveel mitochondriaal DNA is er?
Mitochondriaal DNA: 16,5 kb
Maximaal 1000 kopieën per cel:
Minder dan 1% van de totale hoeveelheid DNA
Wat is de grootte van het humane genoom?
Kern DNA (haploid; 1 kopie DNA): 3 x 10^9 bp = 3000 Mb
Hoe groot is een humaan chromosoom?
Bevat 50 ~ 250 Mb DNA
1,7-8,5 cm lang
Hoe wordt het menselijk genoom gesequencet?
- DNA is gekloneerd in bacterien in kleinere stukken (100 kB)
- Op volgorde van lengte gezet
- Individuele kloons in kleine stukjes gehakt
- Sequentie bepaald met DNA sequencing
- Volgordes aan elkaar geknoopt in computer
Hoeveel eiwit-coderende en RNA-only genen zijn er in het humane genoom?
19.831 eiwit-coderende genen. 25.959 RNA-only genen (rRNA, tRNA enz., overgrote deel functie onbekend)
Wat zijn de algemene kenmerken van het humane genoom?
- Er zijn ~20.000 eiwit-coderende genen in het humane genoom. Dat is maar 1,5x zoveel als in het fruitvliegje, en maar 3x zoveel als in bakkersgist
- Het “proteoom” (de volledige set eiwitten gecodeerd door het humane genoom) is veel complexer dan dat van invertebrate organismen.
- Slechts 1,5% van het humane genoom bestaat uit coderende sequenties (“exoom”). Omdat de meeste genen veel en vaak grote intronen bevatten, wordt ten minste 1/3 deel van het genoom getranscribeerd.
Waar bestaat de helft van het humane genoom uit?
Hoog repetitief DNA afkomstig van transposabele elementen
Wat zijn transposabele elementen?
Elementen die in het genoom zijn gekomen en zich konden verplaatsen binnen het genoom. Transposon activiteit vrijwel geheel verloren (minder genoominstabiliteit). Functie onbekend
Waarom is het X chromosoom goed geconserveerd?
Wegens functie bepalen geslacht, bij meiose onderhevig aan meiotische recombinatie.
In hoeverre verschilt het genoom tussen individuen?
0,1% genoom verschilt van elkaar tussen individuen. Single nucleotide polymorfism (SNIP). In totaal 3 miljoen basen
Wat zijn toepassingen van de humane genoomsequentie?
-Identificeren en kloneren van ziektegenen, inclusief genen die betrokken zijn bij het ontstaan van kanker
-Identificeren van nieuwe genen die nauw verwant zijn aan bekende drug targets. Dit biedt de mogelijkheid nieuwe farmacologische stoffen te ontwikkelen en oude te verbeteren
-Vinden van mutatie die overgevoeligheid voor medicijnen veroorzaken-> dosis aanpassen en zo minder bijwrkingen
Waarin komt het menselijk genoom sterk overeen met dat van gist?
DNA reparatiegenen in mens homoloog aan die in gist
Hoe werken cDNA microarrays?
- RNA uit tumor en normaal weefsel isoleren-> daarvan fluoresecente cDNA gemaakt, daarna mengen.
- Plaatje met op elke plek probes van 1 specifiek gen. Elk puntje staat voor 1 gen. Als gen tot expressie komt kunnen moleculen hybridiseren aan puntje. Als allebei even hoog tot expressie komt krijg je geel puntje, als genen in tumor hoger tot expressie rood signaal, als alleen normaal tot expressie blauw.
- Bio-informatica om te analyseren. Controle vs tumor of tumoren onderling vergelijken
- Validering microarray data met westerns/ RT-qPCR
- Inzicht genen en moleculaire processen die bij kanker verstoord zijn
Wat is het belang van tumoren typeren met microarrays?
-Verbeterde diagnose en prognose
-Verbeterde individuele behandeling
Wat is het nut van genexpressie gegevens clusteren?
Tumorsoorten definieren
Bij welke lymfoom kan de microarray worden toegepast?
Diffuse large B cel lymphoma (DLBCL): de 2 typen B-cellen ontwikkelingsstadia onderscheiden. Activated B-like DLBCL heeft veel slechtere prognose dan GC B-like DLBCL. Met microarray bepalen welk gen tot expressie komt waar die cellen van afhankelijk zijn-> aangrijpingspunt om specifiek een therapie te ontwikkelen.
Hoe kan NGS van RNA (RNA-seq) helpen om genexpressie te begrijpen?
Enorm dynamisch bereik (moleculen tellen)
Gebruik van alternatieve promotoren
Alternatieve splicing
Allel-specifieke gen expressie
Mutatie detectie
Ontdekking van nieuwe exons, niet-coderende RNAs, micro-RNAs
Waarom kijk je bij leukemie naar chromosomale afwijkingen?
- Relevant voor diagnose
- Belangrijk voor prognose
- Respons op chemotherapie
- Identificatie van betrokken genen, mechanisme ontstaan leukemie helpt bij ontwikkeling behandeling
Welke chormosomale afwijkingen zijn definierend voor CML?
t(9;22)(q34;q11)
Welke chromosomale afwijkingen komen bij AML vaak voor?
t(8;21)(q22;q22) good prognosis
inv(16)/t(16;16) good prognosis
Welke chromosomale afwijkingen komen bij MDS voor?
complex karyotype poor prognosis
5q- good prognosis (IPSS-R)
7q- intermediate prognosis (IPSS-R)
Wat is de verdeling van (cyto)genetische afwijkingen bij AML?
49% normaal karyotype (kleine mutaties als NPM1, cebpa, mll, runx1, flt3, ras, wt1)
5% t(8;21)
6% inv(16)/t(16;16) enz. Complex karyotype vaak hele slechte prognose
Hoeveel tijd brengt de cel door in de verschillende celcyclus fases?
G1= 11-14 uur, S 8-9, G2 3-5, M ongeveer 1 uur
Wat is de verhouding tussen DNA in G1 en G2?
G1=0,5x G2
Wat is de rol van tubuline en actine bij de mitose?
Tubuline: binden aan chromosomen
Actine: cytokinese
Wat zijn de gevolgen van taxanen?
De cellen hopen zich op in de M-fase
In welke fasen vindt homologe recombinatie plaats?
S en G2
Welke 2 methoden zijn er om cellen in de celcyclus te bestuderen?
-FACS
-immunokleuring
Wat is FACS?
Fluorescent activated cell sorting
Celcyclusanalyse door kwantificering van het DNA-gehalte
In G1 2n DNA, in S-fase 2n->4n, G2 en M 4N
Hoe wordt FACS uitgevoerd?
- Propidium iodide (PI) toevoegen: fluorescerende stof die bindt aan het DNA. Hoe meer DNA hoe meer binding-> proportioneel aan hoeveel DNA per cel.
- Vervolgens flow cytometer om alle cellen individueel bekijken-> plot fluroescente intensiteit tegen aantal cellen. Nodig dat de cellen allemaal los zijn (bloed maar niet solide tumoren)
Cellen in kweek zijn asynchroon
Waarvoor is immunokleuring geschikt?
- op coupes van biopten van organen (solide tumoren)
- met help van antilichamen tegen celcyclus specifieke eiwitten
Hoe werkt immunokleuring?
Phospho H3 aanwezig in mitose-> antilichaam om cellen in M fase te kleuren. Cycline A-> S en G2.
Wat gebeurt er met een FACS grafiek na bestraling van cellen?
Bestraling: normale verdeling na 24u door herstel met iets minder cellen. Na 4u gaat G1 naar beneden, bij 16u verschijnt piek G1 weer. Cellen met minder DNA in G1 omdat dit cellen in apoptose zijn.
Wat is aphidicolin?
DNA polymerase remmer. Behandeling van prolifererende cellen zorgt ervoor dat S-fase geremd wordt. G2 en M gaan door naar G1. G1 in S-fase gestopt. Alle cellen in S-fase blijven daar. Ophoping in G1 en S
Hoe kan de patholoog bij immunokleuring een inschatting maken van de proliferatie in de tumor?
- zoekt naar cellen in mitose
- zoekt naar cellen in S fase
- gebruikt een antilichaam dat alleen prolifererende cellen aankleurt
- gebruikt een antilichaam dat alleen cellen in mitose aankleurt
Wat is EDU?
Ethynyl deoxy uridine (EDU): nucleotide analoog, als de cel in de S fase is wordt het ingebouwd in het DNA. Kijken hoeveel cellen in de S fase zijn (geweest). Alleen laatste 2 uur van de behandeling toevoegen
Wat is de beste vervanging voor EDU?
Cycline A kan het best gebruikt worden als vervanging voor EdU inbouw
Edu + anti cycline A kleuring: meer cellen gekleurd met cycline A dan Edu omdat cycline A ook de cellen in de G2 fase kleurt
Hoe kweek je cellen?
Whole genome kijken goed op metafase. Materiaal in kweek brengen, want als geen delende cellen geen metafases. In kweekmedium al dan niet met groeifactoren (specifiek voor type leukemie waarvan patient verdacht wordt). 1-2 dagen in kweek. Aan kweek colcemid geven-> zorgt ervoor dat spoeldraden niet meer gevormd/ afgebroken worden, celdeling geremd). Na half uur hypotone oplossing-> cel zwelt op, celmembraan delende cellen onder druk. Fixeren met azijnzuur. Als je cellen op glaasje laat vallen breekt celmembraan open (geen kernmembraan in delende cellen), chromosomen kun je kleuren. Systeem zoekt automatisch naar de metafases
Welke gebalanceerde structurele chromosoomafwijkingen zijn er?
- Translocatie (uitwisseling van terminaal chromosomaal segment)
- Inversie (binnen een chromosoom)
- Insertie
Welke niet-gebalanceerde structurele chromosoomafwijkingen zijn er?
- Deletie (deel van een chromosoom)
- Amplificatie (duplicatie, dmin, hsr)
- Niet-gebalanceerde translocatie
- Gen Mutatie (op niveau van baseparen)
Uit welke delen bestaat een chromosoom?
Alles boven centromeer is korte arm (petit, p-arm), alles eronder de lange arm (q)
Welke soorten inversie zijn er?
Paracentric: within a chromosome arm
Pericentric: round the centromere
Wat zijn break-apart probes?
Bij break point groene probe aan ene kant en rode aan andere kant. Als geen translocatie fusiesignaal (geel), als wel translocatie gaat 1 probe (groene) los. Ook ongebalanceerde translocaties zichtbaar.
Wat is het probleem bij MM diagnostiek?
Bij MM zijn de chromosomen moeilijk te verkrijgen: heel laag percentage afwijkende cellen. Afwijkende cellen delen niet of nauwelijks in lab. Vaak een normaal karyotype, met (lage percentage) afwijkende FISH op interfase kernen> Oplossing: hoger plasmacel percentage-> zuivering van de plasmacellen
Hoe worden plasmacellen gezuiverd?
- Rode bloedcellen verwijderen met rode bloedcel lysis
- Zuivering met anti-CD138 kit (met magnetisch bolletje). Binden aan magneet, alles dat niet gebonden is raak je kwijt, vervolgens buis uit magneet trekken. Houdt alleen de gezuiverde plasmacellen over.
Wat kan een SNP array detecteren?
-Alles behalve translocatie
-Als enige LOH
Wat voor straling wordt voor detectie en therapie gebruikt?
Detectie: g, (b+)
Therapie: a, b-
Welke biologische stoffen kunnen radioactief gemaakt worden?
Normaal I-127 in voeding. radioactieve I-123, I-124, I-131 gebruikt. Schildklier
Water radioactief maken door O16 te vervangen door O15. Kijken naar perfusie weefsels, hart- of hersenaandoeningen
Glucose is maat voor metabolisme. Radioactief maken door OH groep te vervangen door F18: FDG. FDG heeft chemisch andere eigenschappen dan glucose itt I en water.
Wat zijn essentiele eigenschappen voor een radiofarmacon?
- Selectieve binding een specifiek target
- Hoge affiniteit voor target
- Weinig opname in andere weefsels
- Radioactief label niet aan bindingsplek koppelen voor behoud affiniteit
- Geschikte halveringstijd (1-2 uur)
Welke typen radioactiviteit zijn er?
- Radioactief verval met deeltjes (met massa): a (2p + 2n) en b (e-)
- Met elektromagnetische straling (geen massa, alleen energie): fotonen
Welke diagnostische radiologische technieken zijn er?
- Rontgen: transmissie g-straling gemeten door plaat
- Radiofarmacon: spuit stof in, detecteert straling dat uit de patient komt, emissie van straling, zegt iets over functie weefsel
Hoe werkt PET?
Deeltjes die positronen (e+) uitzenden bij verval. Bij botsing tegen elektron annihilatie-> massa omgezet in energie. 2 fotonen die in tegengestelde richting weggaan. Detector ring
Hoe werkt een gammacamera?
1 gamma uit verval gaat alle kanten op, kolimater zijn lodenschatjes die niet loddrechte straling opvangen zodat alleen loodrechte straling gedetecteerd wordt. Daardoor verlies veel fotonen en dus veel informatie
Wat voor plaatjes geeft een gammacamera?
Inherent 2D plaatje, 3D door kop om patient heen te laten draaien: SPECT (singe photon CT), sensitiever (meer details) en lokalisatie beter (specifieker)
Wat voor plaatjes geeft een PET?
Altijd 3D, functie weefsel, lokalisatie (anatomie) minder duidelijk dus daarvoor CT. PET altijd gecombineerd met CT. PET/MRI, MRI geeft beter contrast in weke delen, voor tumoren die op CT lastig te zien zijn
Wat is een botscan?
Kijken naar verhoogde botombouw met tracer die naar de botten gaat (SPECT/CT)
- Botzoekende farmaca: calciumanaloga of bisfosfonaten
- Binden aan hydroxyapatiet
- Accumuleren in actieve botombouw/ -opbouw
- RaCl2 is alfa straler, voor therapie
- Hotspot niet tumorcellen zelf maar reactie botweefsel op metastase
Welke typen skeletmetastasen zijn er?
Osteolytische metastasen die bot afbreken, osteosclerotische waardoor de osteoblasten veel nieuw bot aanmaken (slechte kwaliteit bot). MM bijna altijd osteolytisch, prostaat en mammacarcinoom bijna altijd osteosclerotisch
Wat zijn radionucliden?
Ingebouwd in botmatrix en geeft van daaruit straling
Wat zijn indicaties voor radionuclidentherapie?
- Osteoblastische skeletmetastasen (vooral prostaat en mamma)
- Wisselende localisaties botpijn, als 1 plek vaak uitwendige straling gebruikt
- Niet reagerend op pijnstilling
Samarium b-straling voor pijnstilling, radium levensverlengend bij prostaatcarcinoom (3-4 mnd)
Wat zijn contra-indicaties voor radionuclidentherapie?
- Te weinig beenmergreserve: weinig trombocyten of leukocyten
- Ruggenmergcompressie: wil je snel oplossen, deze therapie daarvoor te langzaam
- Nierfalen
- Zwangerschap
Wat zijn de kenmerken van FDG?
Glucose of FDG in cellen opgenomen door GLUT. Glucose kan cel ook wer uit. In cel gefosforyleerd door hexokinase tot G6P of FDG6P, kan niet zomaar cel uit tenzij gedefosforyleerd door G6Pase (komt in tumorcellen niet/ weinig voor). FDG gaat CZC niet in en blijft dus vast in cel
Wat zijn de voorwaarden voor een botscan?
-Niet eten voor scan (insuline->spier, 6u nuchter)
-Geen excessieve workout 24u voor scan
-1u rusten na injectie
Welke tumoren nemen slecht FDG op?
-Mucineuze tumoren
-Schildklier, prostaat en neuro-endocrien (behalve aggressieve varianten)
Waaraan bindt octreotraat PET?
Somatostatinereceptoren
Wat zijn de verschillende T stadia?
- Hoog gradige dysplasie. Groeit nog niet door BM. Agressieve kanker als het door de BM groeit
- T1: intramucosaal (in slijmvlies_. T1b: submucosaal
- T2: groeit door tot in m. propria
- T3: door alle lagen heen
- T4: doorgroei in andere organen zoals de aorta
Wat zijn de N stadia?
N0 (geen) tot N3 (heel veel)
Welke beeldvormingstechnieken zijn belangrijk bij stadiering?
MRI kan heel goed zien in welke lagen de tumor heen groeit, voor de lokale situatie. CT/PET-CT altijd voor metastasen op afstand
Wat zijn de eisen voor goede kwaliteit zorg?
- Veilig
- Effectief
- Patient-centered: wensen patient centraal
- Op tijd
- Efficient: geld en duurzaamheid
- Equitable: mensen met dezelfde behoeften krijgen dezelfde zorg, geen ongelijkheid
Wat zijn de 3 potentiele pathways voor kwaliteitsverbetring door transparante kwaliteitsinformatie?
- Change pathway: informatie helpt zorgverleners erachter te komen waar ze minder presteren, onderlinge vergelijking
- Selection pathway: patiënten maken keuzes o.b.v. de informatie. Ziekenhuis moet verbeteren
- Reputation pathway: aanbieder probeert al kwaliteit te verbeteren om een slechte reputatie te voorkomen
Wat zijn ongewilde gevolgen van transparantie?
- Weigering van hoog risico patienten
- Interventies uitvoeren als niet strict nodig (voor volume normen)
- Aandacht voor meten i.p.v. verbeteren
- Onzekerheid bij patiënten (‘verkeerde keuze maken’)
- Spanning: informatie die belangrijker wordt voor verantwoording wordt minder bruikbaar voor verbeteren. Getallen opgepoetst, minder herkenbaar voor mensen op werkvloer
Waar krijgen mensen informatie over zorgkwaliteit?
- Van de overheid
- Ziekenhuizen
- Beroepsverenigingen
- Pers
- Patiënten organisaties
