Week 2 Flashcards
Wat is de centrale dogma van de moleculaire biologie?
Informatiestroom van DNA naar eiwit, maar niet andersom
- fout in het DNA heeft dus effect op de eiwitten
- stochastisch proces: opeenstapeling van mutaties (toevalsproces)
Welke verschillende typen puntmutaties zijn er?
Puntmutatie = kleine verandering in DNA wat tot een MIN fenotype (mutationele instabiliteit) leidt
- Transitie/stille mutatie: base veranderd (A↔︎G of C↔︎T), maar aminozuur blijft hetzelfde, geen effect op het eiwit
- Transversie: overgang plaats van een purine (A/G) naar een pyrimidine (C/T) of andersom
* Missense mutatie: aminozuurverandering in een eiwit –> functieverlies en structuurverandering
* Nonsense mutatie: codon omgezet in stopcodon –> korter eiwit –> functionaliteit en structuur beïnvloed
- Deletie: verwijderen 1/meerdere basen –> mogelijk verschuiving van het leesraam –> langer/korter eiwit
- Insertie: toevoeging 1/meerdere basen –> soms leesraamverschuiving of verandering eiwit
Welke verschillende typen chromosomale afwijkingen zijn er?
Chromosomale afwijking = grote verandering in DNA –> leidt tot CIN fenotype (chromosomale instabiliteit):
- Translocaties: uitwisseling van chromosoomstrengen (gebalanceerde is netto geen DNA-verlies, bij een ongebalanceerde wel) –> in het fusie-gen ontstaan nieuwe functies, versterkte functies of verloren functies of deregulatie van de expressie (als het gen onder een andere promotor komt te staan)
- Amplificaties: vermeerdering van de mutatie (toename van DHFR –> toename thymidine synthese –> meer celgroei)
- Deleties: stukken DNA verloren door breuken binnen een chromosoom –> verlaagde expressie eiwit of verlies heterozygositeit (LOH) –> muteerde allel vermeerderd
- Numerieke afwijkingen: te veel/weinig kopieën van een chromosoom (aneuploïde) –> geen evenwichtige verdeling –> over-/onderexpressie van een eiwit of verlies LOH
Wat zijn de 5 oorzaken van DNA-beschadigingen?
- Chemische instabiliteit
- Chemische verbindingen
- Biologische stoffen
- Fysische agentia
- Foutieve replicatie
Wat zijn de 5 verschillende soorten DNA-beschadigingen?
- Chemische adducten: DNA-dubbele helix (niet-)verstorend
- Intrastrengs crosslinks: UV-licht of cisplatine
- Interstrengs crosslinks: 2 guaninen uit aparte strengen aan elkaar
- DNA-streng breuken: enkelstrengse (oxidatieve DNA-schade) of dubbelstrengse breuk (ioniserende straling)
- Basepaar mismatches: translesie synthese of proofreading fouten
Hoe ontstaan DNA-beschadigingen door chemische instabiliteit?
- Spontane hydrolyse: verbinding tussen suikes en base gaat verloren –> depurinatie: 1 basepaar deletie en hierdoor een mutant DNA (frequentie 9.000 per cel per dag)
- Deaminatie van basen: De aminogroep NH2 wordt gehydrolyseerd → Vb. cytosine wordt omgezet in iets dat lijkt uracil → dit hoort niet in DNA maar in RNA. In het voorbeeld is er een C→T transitie, maar dit kan met elke base gebeuren. Bij replicatie wordt er elke keer een andere base ingebouwd: puntmutatie
Hier is niks aan te doen.
Hoe ontstaan DNA-beschadigingen door biologische stoffen?
- Endogene stoffen: oxidatieve DNA-schade. Productie van zuurstofradicalen (metabole processen) ROS –> verandering complementariteit (frequentie 400 per cel per dag) → Guanine wordt door ROS 8-oxoguanine. Hierdoor komt er tegenover een oorspronkelijke G een A en heb je dus in de replicatie een G → T transversie
- Benzo[a]pyreen (in sigarettenrook): bij inhalering omzetting naar benzo[a]pyreen diol epoxide (BPDE) –> hierdoor chemische adducten die de DNA dubbelhelix verstoren, reageert voornamelijk met G-residue, tegenover G-BPDE wordt A ingebouwd –> verandering complementariteit
Welke chemische adducten verstoren NIET de DNA dubbelhelix?
- Spontane hydrolyse
- Deaminatie
- Oxidatieve DNA schade
Hoe ontstaan DNA-beschadigingen door fysische agentia?
Bijv. door UV-straling: hierdoor aanmaak van een crosslink tussen twee pyrimidines –> ontstaan pyrimidine dimeer.
2 soorten crosslink:
- Cyclo; CPD
- 6-4 fotoproduct
Vb. CC, CT, TC en TT
Hier kunnen we wel wat aan doen
Welke 2 DNA-schade reparatiemechanismen zijn er en wat is het basisprincipe hiervan?
- Base Excisie Reparatie (BER)
- Nucleotide Excisie Reparatie (NER)
Principe:
1. Herkenning: DNA-schade
2. Excisie: DNA-schade
3. Herstel: DNA
Hoe werkt het Base Excisie Reparatie (BER) mechanisme?
Enzymatisch proces, herstel van kleine adducten (oxidatieve DNA schade, deaminatie van basen en/of ssDNA breuken)
- Herkenning: DNA glycosylase: de glycosylases zijn schade-specifiek, als ze een fout herkennen zullen ze de foute base naar buiten trekken (base flipping) en wegknippen (N-glycosyl band verbreken) waardoor een abasische plaats (gedepurineerde suiker) ontstaat
- Excisie: AP-endonuclease: herkent een abasische plaats (AP) maakt een breuk aan de 5’ kant van de AP en maakt een enkelzijdige breuk
- Herstel: DNA polymerase en ligase:
* Long patch: DNA-polymerase kan weer binden en nieuwe nucleotiden inbouwen –> na de synthese wordt de overige flap door endonuclease weggeknipt –> ligase zorgt dat de 2 stukken DNA worden gehecht
* Short patch: aan de 3’ kant wordt ook een knip gemaakt door dRP lyases –> abasische nucleotide wegknippen –> polymerase en ligase maken het gat dicht
Vb. Bij oxidatieve DNA schade herkent het eiwit OGG1 de stof 8-oxogyanine in het DNA en dan begint de reparatie.
Hoe werkt het Nucleotide Excisie Reparatie (NER) mechanisme?
Herstel van grote adducten en schade door UV.
- Herkenning:
a. Globaal genoom NER: herkent beschadigingen door het hele genoom (XPC/RAD23B); mutaties voorkomen, signaal voor binden van transcriptiefactor IIH (TFIIH)
b. Transcriptie gekoppelde NER: herkent beschadigingen in getranscribeerde streng van DNA (RNA pol II complex); celdood voorkomen, DNA-polymerase wordt vastgezet, signaal voor binden van TFIIH - Openen van omringende DNA/verwijderen van de DNA schade:
a. Helicase opent/ontwint het DNA, knip gemaakt aan de 3’ kant door XPG → 20-30 moleculen worden weggeknipt
b. hele DNA-polymerase-complex wordt naar achter geduwd naar de mutatie, de mutatie wordt verwijderd en DNA-polymerase kan weer verder - Herstel: DNA-synthese/ligatie: DNA-polymerase vult het gat op en ligase lijmt het gat
Wat houdt de ziekte xeroderma pigmentosum (XP) in en waardoor ontstaat het?
- Extreme zongevoeligheid, pigmentatie-afwijkingen, cataract (beschadigd hoornvlies), droge en harde atrofische huid, huidkanker, versnelde neurologische achteruitgang
- Gevolg van defecten (kan door 8 verschillende genen) in het NER systeem
- Autosomaal recessieve overerving
- Mogen nooit hun huid aan de zon laten zien (grote kans op huidkanker)
- Kans op huidkanker >2000x ↑
Wat houdt de ziekte Cockayne Syndrome (CS) in en waardoor ontstaat het?
- Zongevoeligheid, groeiachterstand, neurologische achteruitgang, netvliesafwijkingen en snellere veroudering (geen kanker)
- Genen CSA en CSB betrokken, kan samen met XP optreden
- Autosomaal recessieve overerving
- Gemiddelde overleving 12 jaar
- DNA-polymerase kan niet verder als het een beschadiging tegenkomt –> apoptose –> snelle veroudering
Wat is een template en welke verschillende soorten heb je?
Voorbeeld van hoe het DNA er in eerste instantie uit zag –> zorgt voor nauwkeurig herstel
- Complementaire DNA-streng: geschikt voor herstel waarbij slechts 1 streng beschadigd is (mismatched basenparen, intrastreng DNA-crosslinks, enkelstreng DNA-breuken)
- Zusterchromatide: geschikt als beide DNA-strengen beschadigd zijn (interstrengs DNA-crosslinks, dubbelstrengs DNA-breuken)
- Homoloog chromosoom: geschikt als beide DNA-strengen beschadigd zijn (interstrengs DNA-crosslinks, dubbelstrengs DNA-breuken)
Wat zijn de verschillen tussen Niet homologe DNA eindverbinding en Homologe recombinatie bij het herstel van dubbelstrengs DNA-breuken?
- Niet homologe DNA eindverbinding: direct aan elkaar ligeren van 2 uiteinden van een DNA-breuk, geen template, onnauwkeurig, vooral actief in G1-fase van celcyclus
- Homologe recombinatie: uitwisseling van DNA-strengen tussen DNA-moleculen, zusterchromatide, nauwkeurig, vooral actief in S-fase en G2-fase van de celcyclus
Hoe verloopt de Niet Homologe DNA eindverbinding bij herstel van dubbelstrengs DNA-breuken?
- KU70/80 eiwit herkent een breuk in DNA
- Complex van 4 eiwitten wordt opgebouwd (DNA-PKcs)
- Ligase bindt en zet het DNA weer aan elkaar vast
- Celdeling gaat door ten koste van nauwkeurigheid in DNA-code
- Defect in NHEJ (zie dia) resulteert in radiosensitiviteit: breuken door radiostraling repareren slecht, bij bestraling overlijden ze onmiddellijk
- Omdat 98% van het DNA niet-coderend is, is het niet erg dat het onnauwkeurig is, hierdoor grotere diversiteit aan antilichamen (door breuken worden stukjes antilichamen in elkaar gezet)en hoge variabiliteit aan immunoglobuline eiwitten
- Fouten kunnen ook leiden tot genomische instabiliteit: interne deleties of translocaties tussen verschillende chromosomen
Hoe verloopt de Homologe recombinatie bij herstel van dubbelstrengs DNA-breuken?
- Enzymen (RAD51) gaan van het dubbelstrengs uiteinde een enkelstrengse staart maken –> van de 5’ kant wordt DNA ‘weggegeten’ waardoor een staart aan de 3’ kant ontstaat
- Staart (met RAD51) gaat op zoek naar een identieke zusterchromatide (base pairing)
- Er vindt DNA-synthese plaats van de missende delen en ligatie van de gebroken strengen
- Er vindt resolutie van de verbonden zusterchromatiden plaats
- Wel mogelijk verlies van heterozygositeit (LOH) als de zusterchromatide of het eigen chromosoom al een mutatie had (hierdoor bijv. ineens een recessieve ziekte aanwezig terwijl de persoon eerst heterozygoot was)
Wat is de invloed van BRCA1/-2 op RAD51?
Deze eiwitten komen van genen die vaak gemuteerd gaan en zorgen dat RAD51 naar de plek van de schade gaat –> DNA-schade induceert een opeenhoping van RAD51
Als BRCA1/-2 gemuteerd is zal RAD51 niet meer naar DNA-breuken gaan –> breuken worden verkeerd aan elkaar gezet –> genomische instabiliteit
- BRCA2-deficiënte cellen vertonen verhoogde frequentie van chromosomale afwijkingen
Wat is de klachtenpresentatie van kanker?
Symptomen treden pas op als de tumor een massa heeft van >1 gram (10^9 cellen, 1 cm^3)
- gemiddeld 5 jaar tot eerste klachten (je zit dan al op 3/4 tussen gezond en overlijden)
Wat is de epidemiologie van kanker?
1 op de 3 mensen in NL krijgt kanker
- 105.000 nieuwe patiënten per jaar
- voornamelijk huid, dikke darm, borst (vrouwen), long en prostaatkanker (mannen)
- incidentie bij de huisarts slechts 11 per jaar (6 man, 5 vrouw), prevalentie 24 man en 40 vrouw
Hoe vindt de DNA-replicatie in het kort plaats?
- Begin op ‘replication origin’ (bepaalde volgorde van nucleotiden) bij herkenning van ‘initiator proteins’
- Aantrekking van eiwitten –> ontstaan eiwit complexen
- DNA-helicase haalt de dubbele helix uit elkaar, ‘single strand binding protein’ beschermt enkelstrengs DNA
- Sliding clamp zorgt dat DNA-polymerase aan DNA bindt hierin vindt replicatie plaats (in katalytisch centrum)
- Replicatie door DNA-polymerase in replicatiegebieden (replicatievorken) van 5’ –> 3’ (leading strand)
- Streng van 3’ –> 5’ (lagging strand) wordt in kleine stukjes van 5’ –> 3’ gemaakt en aan elkaar gezet door Okazaki-fragmenten, hierdoor is wel een RNA-primer nodig
Welke 3 mechanismen zijn er om ervoor te zorgen dat DNA-replicatie nauwkeurig verloopt?
- Base selectie: m.b.v. katalytisch centrum is DNA-polymerase in staat te bepalen welke nucleotide moet worden ingebouwd, hij wordt eerst gepast voordat het covalent wordt gebonden aan de primer (nauwkeurigheid 1 op 1000)
- Proofreading: heel soms vindt er protonverplaatsing plaats (tautomere vorm) en wilt bijv. de C gaan binden met de A, DNA-polymerase maakt niet genoeg onderscheid hiertussen en bouwt hem in, echter vervalt het tautomeer en is de verkeerde nucleotide ingebouwd –> DNA-polymerase kan niet meer verder en dan is er 3’-5’ exonuclease activiteit (verkeerde base uit de streng knippen) –> DNA-polymerase kan weer doorgaan (nauwkeurigheid 1 op 1000)
- Mismatch reparatie: MSH2, MLH1, MSH6 en PMS2 vinden de mismatch en trekken EXO1 aan, deze ‘eet’ de foute nucleotide en een paar eromheen op en het gat wordt weer gevuld door DNA-polymerase (als 1 vd eiwitten niet functioneren → dochtercellen met mutatie)
Hoe kun je een mismatch reparatie defect aantonen?
- Immunohistochemische kleuring: gebruik maken van antilichamen en kijken of eiwitten van het reparatie systeem aanwezig zijn
- Microsatellite instability assay (MSI): om wel aanwezige maar fout functionerende eiwitten te vinden, screening of het mismatch mechanisme werkt op gebieden in genomen (macrosatillite) die (mono-, di-, tri-) nucleotide repeats bevatten –> je krijgt bij replicatie erna of extra inbouw of deletie en dus wijzigt het aantal repeats
(macrosatilllite zijn gevoelige delen in het DNA)
Wat is belangrijk om preventief te doen bij een familiair colorectaal carcinoom?
Dus bij geen aangetoond lynch syndroom
Lifetime risk >10% dus vanaf 50 jaar 1x per 5 jaar een colonoscopie
Wat zijn verwijs criteria na de KG bij aangetoond CRC?
Waardoor wordt DNA schade veroorzaakt, wat zijn de gevolgen en hoe is het te herstellen?
Zie afbeelding voor overzichtelijke samenvatting!
Hoe is de behandeling die afgekort wordt met BEP?
BEP: combinatie van medicatie die breuken in het DNA veroorzaken
- Bleomycine: dubbelstrengs DNA-breuken, concentreert oxidatieve radicalen dichtbij het DNA, bijwerking is verminderde longfunctie (>10%)
- Etoposide: dubbelstrengs DNA-breuken, remt stap 5 van topoisomerase II (zie afbeelding) –> dubbelstrengs breuk met aan uiteinden covalent eiwit wordt niet meer aan elkaar gezet –> chromosomale afwijkingen –> teveel leidt tot apoptose
- Cisplatine: interstrand crosslinks
Wat is synthetische letaliteit?
Het uitschakelen van een reparatie pathway die in tumorcellen en normale cellen zit, dit was voor tumorcellen de enige manier, dus zij overleven dit niet
Gewone cellen hebben nog een ander pathway en zullen zo toch overleven
–> doel is namelijk tumorcellen uitschakelen en normale cellen behouden
Hoe kun je ingrijpen op het base excisie reparatie (BER) proces om tumorcellen te doden?
- BER: Foute DNA eruit geknipt → polymerase vult dat weer op
- Parp1: bindt aan enkelstrengs DNA breuk en gaat ketens van ADP residuen aan elkaar zetten (dit is een soort vlaggetje dat aan het DNA gehangen wordt). Hierdoor worden specifieke reparatie eiwitten aangetrokken → Efficiënte reparatie
- Replicatie zorgt voor een dubbelstrengs breuk. NHEJ niet mogelijk. HR wel, hierdoor kan de replicatievork hersteld worden:
Parp1-remmers: Enkelstrens DNA blijft langer open staan → hierdoor dubblestrengs breuken in cellen die het DNA repliceren → HR nodig
In normale cellen is HR nog aanwezig en kan het reperareerd worden, in tumorcellen kan dit niet meer en zo gaan deze cellen dood
Wat gebeurt er bij erfelijke (BRCA geassocieerde) borstkanker m.b.t. het ontstaan van de kanker en de behandeling?
Dragers van BRCA1/-2 mutaties zijn heterozygoot en hebben een verhoogde kans op het ontwikkelen van kanker (borst, ovarium en prostaat)
- Fenotype mutatie erft autosomaal dominant over
Ontstaan: Inactivatie van het gezonde allel in kankercellen (LOH (verlies heterozygositeit)) –> deficiënt in homologe recombinatie
Behandeling: behandeling met PARP1-remmers (efficiënte enkelstrengsbreuken reparatie verminderd) –> bij normale cel alsnog reparatie maar tumorcellen sterven (synthetische letaliteit)
Hoe kunnen dubbelstrengs DNA-breuken gemaakt worden m.b.v. TMEJ?
Afhankelijk van DNA-polymerase Q –> dit enzym kan ervoor zorgen dat een uiteinde gerepareerd wordt en hiervoor gebruikt hij een paar nucleotiden homologie om de uiteinden bij elkaar te krijgen en vult de rest verder in
–> dus een alternatief als uiteindes richting homologe recombinatie gaan, maar dit niet helemaal voor elkaar krijgen
Hoe zijn de basenparen gekoppeld?
Er is sprake van complementariteit: A zit altijd met T en C altijd met G
- dit omdat A en T 2 H-bruggen kunnen vormen en C en G 3 (sterkere verbinding)
Hoe werkt een PCR (polymerase chain reaction) en wat kun je ermee?
Doel: in kaart brengen van het volledige genoom door het DNA heel vaak te kopiëren
Werking:
1. dubbelstrengs DNA-molecuul uit elkaar door temperatuurverhoging (>90 graden Celsius)
2. temperatuur omlaag –> complementaire primers (aan stukje template-DNA) toevoegen
3. basen worden toegevoegd
4. DNA-polymerase wordt toegevoegd
5. nieuwe DNA strengen worden gemaakt
Welke 2 soorten next generation sequencing zijn er?
- Targeted NGS (amplicon enrichment): specifiek deel van het genoom sequencen, label aan de PCR-primer en hierdoor dezelfde gebieden van verschillende individuen bekijken –> efficiënt, maar 1 fragment uit een bepaald gebied wordt gesequenced
- Hybridization enrichment: DNA in kleine fragmenten splitsen voordat het geamplificeerd wordt, hierna adapters voor latere sequencing toevoegen, interessante gebieden eruit halen (captured) en sequencen –> minder efficiënt, wel meerdere fragmenten van een bepaald gebied
→ hierna bij beide: m.b.v. adapters moleculen binden aan een flowcell –> DNA-fragmenten vermeerderen –> clusters van dezelfde moleculen –> aflezen bouwsteenvolgorde tijdens de synthese (door vergelijking van sequenties achterhalen waar een gen van afkomstig is)
Wat betekenen de begrippen ‘coverage’ en ‘VAF’ bij NGS?
- Coverage (deep sequencing): hoeveelheid dat een base-positie (onafhankelijk) bepaald is, hoe hoger de coverga hoe meer gesequenced is en hoe nauwkeuriger het resultaat
- VAF (variant allel frequency): aantal malen dat een DNA-variant op een specifieke positie wordt gevonden t.o.v. het referentie DNA (afhankelijk van gen en van tumor percentage)
Waarom heeft niet elke tumorcel de mutatie?
- Vaak zit de mutatie maar op 1 van de twee allelen. Dus in sommige cellen is het gezonde allel geactiveerd en wordt er bij sequencing dus geen mutatie gevonden.
- Ook wordt er in een biopt vaak naast tumorcellen ook gezonde cellen geoogst, deze gezonde cellen hebben ook niet altijd een mutatie. Hoe hoger het percentage tumorcellen in het biopt, hoe nauwkeuriger de uitspraak over de mutatie
