VO 6 Flashcards
1
Q
Unterschiede Genom - Proteom
A
- das Genom ist statisch, von allen Genen gibt es gleich viel, man kann Gene vervielfältigen; daher ist das Genom vergleichsweise einfach zu analysieren
- das Proteom ist hochdynamisch (unterschiedlich gesund/krank, ruhend/wachsend, kann sich von einer Minute zur nächsten ändern), Proteine kommen in sehr unterschiedlichen Konzentrationen bzw. Mengenverhältnissen vor
- das Proteom ist schwierig zu definieren
2
Q
Genom
A
gesamtes Erbmaterial eines Organismus, gut definiert, statisch
Genomics = Analyse des Genom hinsichtlich Struktur, Funktion, Evolution usw. (≠ Genetik: einzelne Gene und deren Bedeutung in der Vererbung)
3
Q
Transkriptom
A
Gesamtheit aller Gene, die zu einem bestimmten Zeitpunkt transkripiert sind (“eingeschaltet”)
Hier beginnt die Dynamik!
4
Q
Proteom
A
Gesamtheit aller Proteine eines Organismus oder einer Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt
sehr variabel, reagiert auf äußere Umstände, wesentlich schwieriger zu analysieren
Proteine können abgeschnitten, modifiziert werde oder sich zu Komplexen Zusammenlagern
Human-Proteom 80.000-100.000 Proteine
5
Q
Metabolom
A
Metaboliten in einer Zelle/Organismus zu einem bestimmten Zeitpunkt
chemisch größte Vielfalt (Lipide, Zucker, AS, Peptide, Nukleotide etc.)
6
Q
Ein Gen - viele Proteine
A
- -> alternatives Spleißen: aus ein und derselben DNA und prä-mRNA können verschiedene mRNA entstehen und durch deren Transkription verschiedene Proteine; bis zu 59% der Gene unterliegen diesem Vorgang –> Fehlregulationen in diesem Vorgang können zu Krankheiten führen –> Ein-Gen-ein-Enzym-Hypothese gilt bei Eukalypten nicht !!!
- -> PTMs
7
Q
Posttranslationale Modifikationen (PTMs)
A
- fast kein Protein wird in der Natur so verwendet, wie es nach der Transition der mRNA zunächst vorliegt
- limitierte Proteolyse (viele Enzyme in der Zelle eigens für die Proteinmodifikation)
- Prozesse für PTMs können konstitutiv oder durch Umwelteinflüsse beeinflusst ablaufen
- mehr als 300 verschiedene PTMs sind bekannt; am häufigsten sind Phosphoryleriung (von ATP übertragen), Acetlyierung (von Acetly-CoA übertragen), Sulfatierung, Methylierung, Verknüpfung mit Lipiden oder Glykanen
8
Q
klassische Analytik –> “-omics”
A
- low through put –> hight through put
- meist eindimensional –> mehr dimensional, mehrere Parameter werden gleichzeitig bestimmt
- hohe Genauigkeit, Messergebnis wird mehrmals bestätigt –> niedrige Genauigkeit, viel Rauschen
- Interpretation der Ergebnisse ist simpel (kleines Datenvolumen) –> nur mit Statistik und Bioinformatik interpretierbar (riesiges Datenvolumen)
Idee der “-omics”: die Gesamtheit des Systems analysieren und nicht nur ein Protein, das einen Vorgang einleitet/unterbindet etc. –> Zusammenhänge in realen biologischen Situationen verstehen
9
Q
Proteomanalyse
A
1) Definition der Ausgangsbedingungen un der Fragestellung
2) Probenvorbereitung
3) Quantitative Analyse der Proteine
4) Bioinformatische Auswertung
- meistens mittels Pertubationsanalyse: genau definierte Proteom-Zustände, die verglichen werden sollen, möglichst wenige Unterschiede, Probenmenge im Femptomol-Bereich –> jede Verbesserung der Sensitivität führt zu größerer Analysentiefe, umfassenderen Ergebnissen und vollständigeren Bildern
- quantitative Verhältnisse für das Experiment nicht verändern
- möglichst wenige Schritte
- Sub-Proteom: nur ein bestimmter Teil des Proteoms. (z.B. Proteinkomplexe oder molekulare Maschinen wie Ribisomen) wird betrachtet (dafür Anreicherung oder Abtrennung von Proteinen erlaubt) –> targeted proteomics (Komplexität reduziert, aber man sieht keine unerwarteten Zusammenhänge im ganzen System mehr)
- Herausforderung bei der Analyse: extrem unterschiedliche Proteinmengen (variieren um 10-12 Zehnerpotenzen, z.B. Protein A und B 1:1.000.000.000), heutiger dynamischer Analsyenbereich 10^3 –> deshalb häufige, nicht zu analysierende Proteine abtrennen (oder seltene, zu analysierende anreichern)
10
Q
Klassische Gel-basierte Proteomanalyse
A
- 2-dimensionale Gelelektrophorese: IEF und SDS-PAGE
- bis zu 10.000 Komponenten, in jedem Spot können mehrere Proteine sein
- Quantifizierung über Anfärben: bis zu 20% Fehler (angefärbte Gele werden mit Laser/Scanner erfasst und von einer Software ausgewertet)
- Enzymatische Spaltung im Gel
- Elution mit organischen LM
- Identifizierung über MS: entwerten Abgleich von Peptidmassen mit Datenbanken (peptide mass fingerprint) oder Abgleich von Tandem-MS Spektren mit Datenbanken
- immer mehrere Gele einer Probe (5-10) analysieren für statistisch sinnvolle Daten
11
Q
Peptide Mass Fingerprint
A
- nur für “isolierte” Proteine: funktioniert nur für einzelne, saubere Proteine bzw. Proteine aus einem Spot des Gels (meistens sind dort 1-3 Proteine enthalten)
- Verwendung der Massen der Peptide, die bei enzymatischem Verdau entstehen
- Spaltung meist mit Tyrosin: billig, funktioniert gut, gute durchschnittliche Peptidlänge
- MS-Spektrum wird erstellt –> Peakliste –> Umrechnen von m/z auf m, mehrfach geladene Ionen auf eine Ladung umrechnen –> in eine Suchmaschine geben
- Datenbank hinterlegt –> Score wird berechnet für Grad der Übereinstimmung des untersuchten Proteins mit den hinterlegten
- Methode kann nur angewendet werden, wenn Protein bereits in der Datenbank hinterlegt (menschliches Protein relativ wahrscheinlich, Pflanzen/ Viren-Protein eher unwahrscheinlich)
- wegen möglichst reiner Isolierung für optimale Ergebnisse oftmals MS/MS-Methoden zur Identifizierung sinnvoller
12
Q
Proteomics mittels MS/MS
A
- anwendbar für isolierte Proteine und Protein-Gemische
- Protein(Gemisch) wird enzymatisch verdaut (z.B. in Gel der vorherigen Elektrophorese –> Trennung der Spots mit 2D-LC) –> in MS geben (man erhält zusätzlich zur Masse auch Sequenzinfos)
- Peptidsequenzen werden mit Datenbank verglichen mit ebenfalls verdauten und fragmentierten Proteinen in der Datenbank
- etwas kompliziertere Ergebnisse: alle Peptide einer möglichst kleinen Zahl an Proteinen zuordnen
13
Q
SEQUEST
A
- man erhält bei MS über Stunden hinweg mehrere Tausend Spektren für eine Probe
- Auswertung läuft automatisch mit SEQUEST
- identifiziert jedes Tandem-MS individuell, erstellt dann eine Liste mit potenziellen Peptiden gleicher Masse –> potentielle Spektren der möglichen Peptide werden berechnet und verglichen –> ergibt Sequenz, die am besten zu den Daten passt und am wahrscheinlichsten ist (wird dann mit einem Score versehen)
14
Q
Mascot
A
- Software für die Auswertung von MS und MS/MS-Daten von Peptiden
- berechnet die Wahrscheinlichkeit, dass der Match zwischen den experimentellen Daten und den hinterlegten zufällig ist –> Dasjenige Peptid, das am wenigsten wahrscheinlich durch Zufall zu den Daten passt, bekommt den höchsten Score
15
Q
Proteomanalyse ohne Gel
A
- enzymatischer Verdau des Protein-Gemisches
- direkte label-freie Quantifizierung nur in Ausnahmefällen
- Quantifizierung mit Labels: stabile Iostope (13C, 15N, 2H, 18O) in Proteom eingeführt
- Metabolische Isotopenmarkierung;
- Zellkultur mit 15N- angereichertem Nährmedium
- SILAC (stable isotope labelling by amino acids in cell culture – 2 Zellkulturen werden 5 Zyklen laufen gelassen, einmal mit markierten AS, einmal ohne –> dann Probe 1:1 mischen –> relative Quantifizierung so möglich
- chemische Isotopenmarkierung:
- ICAT( isotope coded affinity tag –> vor oder Nach dem Verdau, aber nach der Zellernte, tag wird eingebracht)
- GIST (global internal standard technology –> Modifizerung der freien NH der AS und Lys nach dem Verdau)
