VO 3 Flashcards
1
Q
Sequenzanalyse: Massenspektrometrie
A
- ersetzt zunehmend den Edman-Abbau: weniger Probe benötigt, kürzere Analysenzeit, keine hohen Reinheitsanforderungen an die Probe, N-Terminal-blockierte AS lassen sich auch analysieren
- man kann neben der Sequenz auch die PTMs bestimmen (wichtig bei Proteomics)
- ebenfalls limitiert, was die Größe der Proteine angeht –> zuvor enzymatischer Verdau wichtig
- keine Möglichkeit, Leucin von Isoleucin zu unterscheiden
- MALDI und ESI erlauben es (Bio)Polymere intakt (ohne Fragmentierung durch zu hohe Energie) zu ionisieren
- MALDI: bis zu 1 Mio g/mol, gepulste Ionisationsmethode (diskontinuierlich)
- ESI: bis zu einigen 10.000 g/mol, kontinuierlich ionisierend (lässt sich mit verschiedenen chromatographischen Methoden koppeln)
2
Q
MALDI
A
= matrix assisted laser resorption ionization
- Probe wird in UV-absorbierende Matrix eingebettet
- LM verdampft –> Kristallisation von Matrix und Analyt (Analyt MUSS in Kristallgitter der Matrix liegen, um daraus ionisiert werden zu können)
- Matrix: kleine organische Moleküle, die den Laser stark absorbieren, oft sauer (geben dann bei der Ionisation ein Proton an die Probe ab)
- Laser: Nd-YAG-Laser, Wellenlänge 355 nm, Pulsdauer 5-15 ns
- Elektronenanregung wird absorbiert, führt zu starken Störungen und Ausdehnungen im Kristallgitter –> Probe und Matrix gelangen explosionsartig in de Gasphase
3
Q
MALDi-TOF
A
- gängige Kombination: MALDI mit TOF (Flugzeitanalysator)
- Trennung nach Flugzeit der verschieden schweren = verschieden schnellen Ionen für eine vorgegebene Strecke
- TOF optimal für größere MAssen und gepulster Ionisierung
- TOF ist sehr empfindlich, delektiert fast alle Ionen, die die Ionenquelle verlassen
- Ionen werden nach Entstehung beschleunigt (Spannung zwischen Probenplatte und Beschleunigunsplatte zieht die Ionen durch Öffnung in Beschl.-Platte, dort dann einer Spannung ausgesetzt und ins Flugrohr geleitet)
- Ionen haben beim Übergang ins Flugrohr idealerweise die gleiche kinetische Energie (schwere Ionen sind schneller als Kleine, proportional)
- Flugzeit: gemessen ab Laserimpuls gemessen, kann danach in m/z-Werte umgerechnet werden
- lineare TOF: Flugzeit wird nach direktem Durchlaufendes Flugrohrs gemessen –> maximale Empfindlichkeit
- Reflektron-Modus: Ionen landen in einem elektrischen Gegenfeld und werden umgelenkt –> schnelle Ionen im Vergl. mit langsameren der gleichen Masse gelangen tiefer ist Gegenfeld und brauchen so auch länger wieder heraus, Detektor genau an dem Punkt, an dem die schnellen die langsamen gleicher Masse wieder aufgeholt haben –> scharfes Signal, Auflösung und Genauigkeit verbessert, optimal für die Analyse nicht zu großer (> 20.000 g/mol) und stabiler Moleküle
4
Q
Störfaktoren bei MALDI-TOF
A
- Veränderung der Masse des Proteins bei der Aufreinigung: z.B. Cystein –> reagiert mit Acrylamid Monomer bei Elektrophorese oder mit Mercaptoethanol; Lysin –> freies NH3 oder N-terminales Amin leit modifizierter; Methionin –> Oxidation mit Lufsauerstoff
==> führen zu einer breiteren Massenverteilung
5
Q
N-terminale Leitersequenzierung
A
- Edman-Abbau: Pepcid-Leiter (Satz von peptiden, jeweils um eine AS verkürzt) –> Massendifferenzen liefern die AS
- Abbau normalerweise 30 min + anschließend HPLC: hier aber nur 5 min + anschließend MALDI-TOF
- Nachteil: keine Unterscheidung von Leucin und Isoleucin möglich
6
Q
Sequenzierung über PSD-MALDI
A
PSD = post source decay
- gezielte Änderung der Desorptionsbedingungen: Molekülionen können während der Beschleunigung in elektrischen Feld zerfallen (metastabile Fragmentierung) –> geladenes Fragment-Ion + Neutralteilchen entsteht
- sehr aufwendige Interpretation der Spektren, ABER sehr viel schneller als Edman-Abbau und hohe Empfindlichkeit der MALDI-MS
- lässt sich auch mit modifizierten Peptiden durchführen, wo Edman-Abbau versagen würde + keine vorherige chromatographische Trennung bei Gemischen nötig
- bis 2 kDa funktioniert gut
7
Q
ESI
A
ESI = electrospray ionization
- kontinuierliche Ionisation, lässt sich mit anschließender Chromatographie koppeln
- Messung von Proteinen bis zu mehreren 10.000 Da
- Ionisation mittels Zerstäuben
- wichtig: protische und polare LM verwenden!! –> Analyst muss darin auch gut löslich sein
- Bildung der Ionen durch Protonierung/Deprotonierung oder Anlagerung von Alkalimetall-Ionen
- Substanzlösung wird über dünne Stahl- oder Quarzglas-Kapillare in Ionisationskammer gesprüht –> Spannung zwischen Sprayschild und Kapillare angelegt (1-5 kV)
- in der Kammer: Vakuum, hoch geladene Teilchen kommen in den Raum –> Coulomb-Explosion: LM verdampft, Ladung in Tropfen rückt näher zusammen und stößt sich irgendwann so ab, dass Tropfen sich explosionsartig teilen; so oft wiederholt, bis einzelne Ionen als Tropfen auseinandersprengen
- Ionen wandern durch ein Loch im Sprayschild ab und werden fokussiert zum Analysator weitergeleitet (z.B. HPLC)
- off-axis Design: Probe wird nicht senkrecht auf das Sprayschild gesprüht sondern in einem Winkel –> toleranter ggüber hohen Flussraten und Verschmutzungen
- besonders gut geeignet zum Ionisieren polarer Verbindungen (bereits in Lösung ionisiert worden)
- Zusätze wie Ameisensäure oder Alkalimetall-Ionen helfen bei der Ionisierung in Lösung vor dem Sprayen (wichtig!!, es sollte der gesamte Analyt ionisiert vorliegen)
- Reagenzien (Puffer Detergenzien, etc.) von der Reinigung müssen komplett abgetrennt sein, führen zu Störungen und Schäden bei ESI
- nochmal sanfter als MALDI
- oft mit Ionenfallen gekoppelt (z.B Quadrupol, Orbitrap)
8
Q
ESI-Massenspektrum
A
- Intensität gegen Masse-zu-Ladungsverhältnis m/z aufgetragen
- Ionen mit hoher Ladung weiter links im Spektrum
- Abstand zwischen den einzelnen isotopischen Peaks ist immer 1/z
9
Q
Sequenzierung mit ESI-MS: de-novo Sequenzierung
A
Fragmentierung mittels Tandem-in-space oder Tandem-in-time MS
Tandem-MS (MS/MS oder MS^2):
- im ersten Analysator wird nach m/z aufgetrennt und ein Ione isoliert
- isoliertes Ion Wanderin in Kollisionszelle mit Gasteilchen von Inertgas –> stoßinduzierte Fragmentierung (CID)
- entstandene, leichtere Ionen werden nochmal massenspektrometrisch analysiert
- Beide Analysen zeitlich oder räumlich getrennt
- räumliche Tandem-MS: zwei MS in Serie (z.B. TOF-TOF)
- zeitliche Tandem-MS: Analyse im gleichen Analysator, aber zeitlich hintereinander (z.B. Quadrupol-Ionenfallen, FT-ICR-Analysatoren) –> MS^n: Vorgang kann beliebig oft (n-Mal) wiederholt werden (geht bei räumlicher Trennung nicht)
- primäre Fragmentierung der Peptide mit ESI zwischen dem Carbonyl-C und dem Amid-N
10
Q
ESI-MS: Möglichkeiten der Fragmentierung
A
- Fragmentierung mittels Kollisionen: collision induced dissociation (CID), higher energy collisional dissociation (HCD) –> CID (mehrere Zusammenstöße mit Gasatomen oder -molekülen führt zu Fragmentierung), HCD (hohe Energie –> ein Zusammenstoß genügt, da Ionen schneller/energetischer + Seitenketten-Abspaltung, da kann man Isoleucin von Leucin unterscheiden)
- Fragmentierung mit Elektronen: electron capture dissociation (ECD), electron transfer dissociation (ETD) –> funktioniert nur mit mehrfach geladenen Ionen (M^3+ + 1e- => M^2+); Vorteil: PTMs bleiben erhalten
- Fragmentierungen mit Licht: funktioniert mit UV und IR, IR muss aber länger eingestrahlt werden, weil weniger energiereich
- Fragmentierung an der Oberfläche: surface-induced dissociation (SID) –> Ionen werden auf Oberfläche hin beschleunigt und fragmentieren bei Aufprall
11
Q
Verschiedene Arten der Fragmentierung in einer Orbitrap
A
- CID: Ionenfalle
- HCD: Kollisionszelle
- ETD: Kollisionszelle + Anthrazen-Anionen als Elektronenquelle
12
Q
Verschiedene Arten der Fragmentierung in einer FT-ICR
A
= Massenspektrometer mit der höchsten Auflösung
CID, ECD und IRMPD (infrared multiphoton dissociation) sind möglich
13
Q
De-novo Sequenzierung
A
- jedes Fragment in einer Fragment-Serie unterscheidet sich in seiner Masse einer AS vom Vorläufer –> nur aus der Fragmentierung lässt sich die Peptid-Sequenz ermitteln (Datenbanken etc. nicht zwingend erforderlich, unbekannte Peptide lassen sich analysieren)
- Probleme: mehrere Serien gleichzeitig delektiert (y-, b-Serie etc., das ist aber auch gut und wichtig so!!), viele Signale gehören zu keiner Serie (interne Fragmente), Abspaltungen aus den Seitenketten des AS (z.B NH3 Verlust oder H2O weg)
- manuelles Auswerten sehr zeitaufwendig, aber möglich, oft nimmt man dennoch Datenbanken zur Hilfe
- wichtig ist eine hohe Auflösung und Massengenauigkeit
14
Q
Sekundärstrukturanalyse mittels Circulardichroismus (CD)
A
- Analyse der Sekundärstruktur: Anteile von alpha-Helix, beta-Faltblatt, random coil Strukturen
- Circulardichroismus:
- Eigenschaft von optisch aktiven Molekülen
- einer polarisiertes Licht: zwei Wellen 90° zueinander verschoben –> eine links drehend, andere rechts drehend
- wird links- und rechtsdrehend unterschiedlich stark absorbiert, spricht wan von Circulardichroismus (“charakteristische” Differenz für die jeweilige Struktur)
15
Q
CD-Messung
A
- monochromatisches Licht (durch Monochromator erzeugt) wird linear polarisiert –> CD-Modulator wechselt dann zwischen link- und rechtsdrehend –> wird durch Küvette mit Probe geleitet –>Werte werden registriert und bei verschiedenen Wellenlängen nochmals gemessen
- Werte (links und recht miteinander verrechnet) aufgetragen gegen die Wellenlänge geben CD-Spektrum
- elliptisch polarisiertes Licht: entsteht bei unterschiedlicher Absorption von rechts- und linksdrehend
