VO 5 Flashcards
1
Q
Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
A
- für Proteine > 250 kDa
- Auflösung ca. 3,5 Å
- Darstellung von Protein-Komplexen auf annähernd atomarer Ebene
- Elektronenstrahl (im Vakuum, damit kein Zusammenstoß mit Luftmolekülen, Quelle meistens Wolramdraht) wird mit Linsen fokussiert durch die Probe geschickt –> Elektronen die durch die Probe gelangen, erzeugen das Bild
- Probe: Schichtdicke weniger als 100 nm (Probe mit Kontrastmittel versetzt in Harz einbetten und ausreichend dünn aufschneiden), auch als Suspension auf einem Gitter (meistens Metallgitter)
- Beschleunigungsspannung: 80 - 400 kV (für biologische Proben 80-200(120) kV relevant)
- höre Auflösung als bei Lichtmikroskop möglich, weil geringere Wellenlänge
- Bild wird vergrößert und auf Detektor fokussiert
- Detektor: Leuchtschirm (direkte Betrachtung) oder Fotoplatten, CCD-Kamera
Cryo-TEM:
- Probe wird bei Temperatur von flüssigem Stickstoff in flüssigem Ethan schockgefroren (Wasser kristallisiert. nicht, sondern bildet glasartiges Eis)
- Abbildung der Proteine im nativen Zustand so möglich
2
Q
Rasterkraftmikroskopie (atomic force microscopy AFM)
A
- kann einzelne Proteine unter nativen Bedingungen abbilden und deren Dynamik sichtbar machen
- mechanische Abtretung er Oberfläche und Messung atomarer Kräfte im Nanometerbereich
- nanoskopisch kleine Nadel an verbiegbarer Feder fährt in einem Raster über die Oberfläche –> Verbiegung der Feder wird von einem Sensor detektiert –> zu einem Bild zusammengefügt (im Idealfall lassen sich sogar einzelne Atome abbilden)
- kein Strom an der Spitze: kann auch nicht-leidende Proben untersuchen
- kann sensible Oberflächen in Flüssigkeiten, z.B. Puffer abbilden
- sehr wenig Energie wird übertragen, deshalb kein Einfluss auf die native Funktion des Proteins
- man kann auch Liganden an der Spitze immobilisieren und dann damit abrastern und die Stärke der Bindung zum Protein messen
Kräfte zwischen Sonde und Oberfläche:
- Kraft bei Kontakt von Elektronenhüllen: abstoßend
- VdW-WW: anziehend
- elektrostatische WW: anziehend oder abstoßend
- Kapillarkräfte: anziehend
3
Q
Röntgenstrukturanalyse
A
- für die Aufnahme eines 3D-Modells im atomaren Bereich mit Röntgenstrahlen muss das Protein kristallisierbar sein
Arbeitsschritte:
- Kristallisation: Protein bestmöglich reinigen (man braucht große Einkristalle) –> zwei Möglichkeiten: Fällungsmittel diffundiert zur Proteinlösung oder Wasser diffundiert aus Proteinlösung (Fällungsmittel: Salze, Polyethylengylkol, Alkohole); beliebte Methode “hanging drop”: Tropfen mit Probe, Puffer und Fällungsmittel (anfangs klar), darunter Reservoir mit höherer Fällungsmittelkonzentration, System mit Silikon abdichten –> Dampfdiffusion (Fällungsmittel gelangt in Tropfen, seeehr langsam, Kristall wächst langsam und groß –> man benötigt ca. 10-200 Kristalle für de-novo Strukturaufklärung
- Charakterisierung der Kristalle: Kantenlänge von 0,1-0,3 mm; Raumgruppen und Größe der Einheitszelle bestimmen; Kristalle enthalten 50-60% Kristallwasser und müssen ständig in Puffer sein (sonst sehr instabil)
- Aufnahme der Röntgenbeugungsdaten: Großteil der Strahlung geht durch, Rest wechselwirkt mit Elektronenhüllen im Kristall –> Elektronen werden angeregt und geben beim Zurückfallen Röntgenstrahlung frei (Interferenzen entstehen)–> diese wird detektiert (auf Fotoplatte aufgezeichnet) –> danach Probe drehen und nochmal
- Bestimmung der Phasen: werden mithilfe von Schweratomen bestimmt, können nicht direkt gemessen werden; 3 Größen, die die Infos über den Aufbau des Moleküls wiedergeben: Phase, Wellenlänge, Amplitude
- Interpretation der Elektronendichte: Hineinmodellieren der Polypeptidketten in die 3D-Karte der Elektronendichte (Primärsequenz muss bekannt sein!), Auflösung meistens 2-3 Å (Helices erkennbar, Postenkette verfolgbar), aber ab 1 Å einzelne Atome sichtbar
- Verfeinerung des Strukturmodells: zusammen mit NMR eingesetzt; kristalline Struktur des Proteins zwar richtige Gestalt, aber nur “Momentaufnahme” in gewisser Umgebung
4
Q
3D-Strukturanalyse eines gesamte Proteins
A
kleinere Teile mit NMR und Röntgenkristallographie untersuchen, Cryo-TEM gibt Aufschluss über gesamtes Protein –> alle Informationen in einem Modell vereinen
5
Q
Datenbanken
A
- protein data bank: Kristallstrukturen, frei zugänglich
- universal protein resource (uniprot): Sequenzen, strukturelle Informationen, Bioinformatik, frei zugänglich
6
Q
Analytik von Bindungsvorgängen
A
wichtig sind hier die nicht-kovalenten Bindungen, kommen z.B. bei Enzym-Substrat-Bindung, Antigen/Antikörper, Rezeptor/Ligand vor
- ionische Wechselwirkungen
- Wasserstoffbrücken
- Van-der-Waals-Kräfte
- hydrophobe Wechselwirkungen
7
Q
Chemisches Gleichgewicht
A
- Gesamtreaktion scheint ruhend, aber Hin- und Rückreaktion laufen gleich häufig ab, deshalb keine Konzentrationsänderung der Produkte auf beiden Seiten = dynamisches Gleichgewicht
- Bindung eines Liganden wegen Kumulation stark exergonisch –> stark exergonisch, Bindungsenthalpie aber immer noch unterhalb der einer kovalenten Bindung
- Bindungskonstanten werden über die GGW-Konzentrationen bestimmt und lassen Aussagen über die Stärke der Bindung zu
8
Q
Immunologische Techniken (allgemein)
A
Antikörper als Reagens:
- IgA, D, E, G, M
- IgG als analytischer Antikörper (sehr häufig vorhanden, aus dem Serum von Tieren leicht zu gewinnen, gut löslich, reagiert zwischen pH 4 und 9,5, gut und lange lagerbar, reversibel denaturierbar –> Affinitätschromatographie)
- Paratop: befindet sich am variablen Teil, Haftstelle zum Antigen (die meisten Ig divalent = zwei Bindungsstellen, IgM 10 Stellen = multivalent)
Antigen:
- Substanz, für die ein Antikörper existiert
- Hapten: kleinere Moleküle, die noch an einen Träger gekoppelt werden müssen um immuneren zu werden (inkomplettes Antigen)
- Epitope: Regionen, die mit Antikörpern spezifisch interagieren können (Antigene Determinanten) –> meistens multivalent (viele Stellen, an denen interagiert werden kann –> kann man analytisch nutzen)
9
Q
Antigen-Antikörper-Reaktion
A
- Affinität: Bindung einer Antikörper-Bindungsstelle mit einem Epitop
- Avidität: Multiplizieren der einzelnen Affinitäten = Gesamtbindungsstärke (IgG: 2 Bindungsstellen = K x K = K^2)
- Avidität setzt sich zusammen aus: Affinität, Multivalenz des Antikörpers, FC-Assoziation (FC= bestimmte Region am Antikörper) zwischen Antikörpern nach Antigenbindung
- Agglutination (Zusammenklumpen): wird beobachtet, wenn ein Partner ein Korpuskel ist
- Präzipitation: beide Partner waren ursprünglich löslich, fallen aber in richtigem Verhältnis als kreuzvernetzter Niederschlag aus (wie viel genau bei welchem Verhältnis ausfällt, beschreibt die Heidelberger Präzipitationskurve)
10
Q
Radioimmunoassay (RIA)
A
- sensitiveste Methode der Bestimmung der Antigenkonzentrationen
- man arbeitet mit radioaktiv markierten Antigenen (genau definierte Menge) und gibt diese zusammen mit Antikörper und zu bestimmender Lösung mit Antigen
- nichtmarkiertes Antigen verdrängt radioaktives Antigen, Bindung wird danach vom radioaktiven Antigen gemessen und gibt Rückschlüsse auf Konzentration des unmarkierten
- trotz Radioaktivität für spezielle Diagnostik verwendet
- in Lösung möglich, immobilisierter Antikörper aber einfacher, weil man ungebundenes Antigen einfach auswaschen kann und nicht ausfällen muss
11
Q
ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)
A
- Bestimmung der Antigenkonzentration aufgrund einer enyzmatischen Farbreaktion
- wesentlich einfacher durchzuführen als RIA, länger lagerfähig, kein radioaktiver Abfall, keine besonderen Schutzvorkehrungen
- ermöglicht die Quantifizierung von Antigenen, die in niedriger Konzentration in einem komplexen Gemisch vorliegen
Ablauf Sandwich-ELISA:
- Erstantikörper (Fänger) an feste Phase binden
- ungebundener Antikörper auswaschen
- Probe zugeben, 30 min Inkubationszeit
- waschen
- Zweitantikörper (Detektor) zugeben, an diesen ist ein Enzym gekoppelt
- waschen
- farbloses Substrat für Enzym zugeben –> farbiges Produkt entsteht
- Reaktion nach bestimmter Zeit stoppen
- in Photometer das farbige Produkt messen
verdünnten Standard und Blank mitlaufen lassen für Kalibrationskurve
12
Q
Biacore-Technik
A
- funktioniert label-frei, schonend und mit geringen Mengen durch Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)
- ermöglicht Messung spezifischer Bindungsreaktionen v.a. Wirkstoff-Target-Bindungen –> Assoziation und Dissoziation in Echtzeit verfolgen und quantifizieren (Informationen über die Reaktionskinetik)
- Technik: Sensorchip in einer Mikrozelle, die ständig durchströmt wird, Bindungspartner an der Innenseite der Mirkozelle befestigt –> Bindungsreatkion finde statt (funktioniert für jedes Bindungspaar aus biologischen Molekülen), kann man einsetzen um z.B. den besten aus einer Reihe von (potenziellen) Bindungspartnern zu finden
13
Q
Oberflächen-Plasmonen-Resonanz (surface plasmon resonance, SPR)
A
- hohe Sensitivität, hohe Zeit-Auflösung, kabelfrei, kein mechanischer Einfluss auf die Probe
- An der Grenzfläche von Metallen zu einem Dielektrikum bildet sich ein Elektronengas, das unter bestimmten Bedingungen (abhängig vom Einfallswinkel und Brechungsindex des Mediums) durch Licht in Schwingung versetzt werden kann –> Energierhaltung: Licht wird eingekoppelt (Resonanz) –> “Welle” parallel zur Metalloberfläche entsteht (=Plasmon), Plasmon kann ca. 300 nm von der Oberfläche weg “sehen”
- Lichtquelle: Helium-Neon-Laser
- mit Gold überzogenes Glasprisma erzeugt Plasmon
- reflektiertes Licht wird mit Photozelle detektiert, gemessen wird die Änderung des Brechungsindex (“optische Schichtdicke”) –> kann Anlagerung einer Schicht von wenigen Å beschreiben
- kann nicht unterscheiden ob viele kleine, oder wenige große angelagert wurden
Schritte der SPR-Messung:
- Antigen-Adoption am Goldfilm
- waschen
- Antikörper-Bindung aus der Lösung
- Waschen (+ Dissoziation niederafferenter AK)
- Dissoziation mit denaturierendem Puffer
- Regeneration der Oberfläche
- -> aus der entstehenden Kurve kann man Assoziationsgeschwindigkeit (beeinflusst durch einen immobilisierten Partner –> anders als in Lösung) und Dissoziationsgeschwindigkeit ablesen und daraus Gleichgewichtskonstante berechnen
14
Q
Isotherme Titrationkalorimetrie (ITC)
A
- Messung von Bindungsvorgängen, wenn beide Partner in Lösung sind: Untersuchung der Bindung von kleinen Molekülen (z.B. Wirkstoffe) an größere Makromoleküle (z.B. Proteine, DNA, etc) und thermodynamische Charakterisierung
- quantitative Messmethode für Bindungsaffinität, Bindungsenthalpie und Bindungsstöchiometrie
- -> Berechnung der Gibbs’sche Enthalpie und der Entropie daraus möglich
Aufbau:
- zwei identischem hochwärmeleitende Materialien in wärmedicht abgeschlossenen Zellen (eine Referenzzelle mit Puffer/Wasser, eine Probenzelle mit Makromolekül im gleichen Puffer/Wasser; wenige ml Flüssigkeit in beiden Zellen), wird mit konstanter Leistung beheizt (in der Probenzelle mit Rückkopplungsmechanismus., temperaturabhängig)
- genau bestimmte Menge Liganden zugeben –> Aufnahme oder Abgabe von Wärme an die Flüssigkeit –> Messungen zeitabhängigen Energiezufuhr um die gleiche Temperatur wie in der Referenzzelle wieder zu erreichen (Anpassung über den Rückkopplungsmechanismus)
- exotherm –> weniger Energie wird benötigt; endotherm –> mehr Energie wird benötigt
- Ergebnis wird angegeben in µcal/s in Abhängigkeit von der Zeit (in s)
- Diagramm mit Spikes –> an jedem Spike eine Ligandeninjektion (Integration in Abhängigkeit von der Zeit der Spikes entspricht der benötigten Energie zur Wiedereinstellung der Temperatur)
- Proben vor der Verwendung unter Vakuum entgasen, weil Luftblasen die Messung stören können
