VO 2 Flashcards
Elektrophoretische Verfahren (allgemein)
Elektrophorese = Wanderung von geladenen Teilchen in einem elektrischen Feld
- hauptsächlich Träger-Elektrophorese: Auftrennung in oder auf Trägermaterialien (z.B. auf Papier oder in verschiedenen Gelen)
- große Nukleinsäuren –> Agarose-Gele zur Auftrennung
- kleinere Nukleinsäuren und Proteine –> Polyacrylamid-Gele
- häufig Auftrennung unter denaturierenden Bedingungen nach der Molekülmasse
- native Elektrophorese: Auftrennen unter nativen Bedingungen nach Molekülmasse, Konformation und Teilchenladung
- farblose Moleküle anfärben: Nukleinsäuren –> Ethidiumbromid; Protein –> Coomassie-Brilliantblau
- 3 verschiedene elektrophoretische Verfahren: Zonenelektrophorese, Isotachophorese, isoelektrische Fokussierung
- allgemein sehr hohes Auflösungsvermögen, deshalb oft in der Analytik und präparativ angewendet
- Wanderung in Lösung in Kapillaren nur nach Ladung
- Wanderung in stabilisierenden Matrices (Membranen oder Gele) nach Ladung und Größe
SDS-PAGE Aufbau
SDS = sodiumdodecylsulfate PAGE = polyacrylamid gel electrophoresis
Gelelektrophorese:
- Wanderung von Ionen bestimmt durch Nettoladung, molekulare Masse und Konfirmation
- freie Bewegung wird durch Glematrix behindert/gelenkt
- wird eher für die Analyse (molekulare Masse abschätzen und Reinheitsgrad bestimmen) verwendet als für die Isolierung
SDS:
- anionische Detergenz mit großer Affinität zu Proteinen (1 SDS pro 2 AS) –> denaturiert bei der Bindung das Protein
- zusätzlich werden Disulfidbrücken aufgebrochen mit Mercaptoethanol oder Dithiothreitol
- SDS negative Ladung überdeckt die ursprüngliche Ladung des Proteins –> Verhältnis Ladung/Masse wird für die Proteine nahezu gleich –> alle SDS-Proteine wandern zur positiven Anode
- Beschleunigung für alle fast gleich, aber Gelmatrix bremst größere Moleküle stärker als kleine (Molekularsiebeffekt)
PAGE:
- Netzwerk aus Acrylamid mit N,N’-Methylenbis(acrylamid) mit definierter Porengröße –> Verhältnis der beiden Stoffe steuert die Porengröße
- für die Trennung von Proteinen zwischen 20 und 250 kDa geeignet
- Zugabe von SDS löst Proteinaggregate
- molekulare Masse kann dann über Proteinstandard bestimmt werden (Gemisch aus Proteinen bekannter Massen)
- v.a. eingesetzt zur Reinheitsbestimmung oder der Abschätzung der Proteinkonzentration
SDS-PAGE Ablauf
- Gel ist in Gelkammer zwischen zwei Glas- oder Plastikplatten (vertikal)
- Probe wird in die Löcher des Gelkamms pipettiert, Proteinstandard läuft seitlich mit
- Puffer: meistens schnelle Ionen im Gel (Chlorid) und langsame im Kathodenpuffer (Glycinat)
SDS-PAGE System nach Lämmli (am häufigsten angewendet):
- diskontinuierliches System aus zwei Gelen (oben Sammelgel, unten Trenngel –> unterscheiden sich in Porengröße, pH und Ionenstärke)
- Sammelgel: Puffer aus TRIS/Chlorid, pH 6.8 –> Glycin als Zwitterion –> zwischen den Lauffronten von Chlorid (Leition) und dem Folgeion (Glycin) bilden sich Proteinstapel, die gleich schnell wandern
- Änderung des pH und der Porengröße, wenn Trenngel erreicht wird –> Proteinstapel stauen sich auf (Glycin wird zu Glycinat und wandert schneller) und werden anschließend nach ihrer Größe aufgetrennt
- zuerst Konzentrierung im Sammelgel und dann Trennung im Trenngel –> schärfere Bande, größere Probenvolumina möglich
- Proteinbanden müssen mit Coomassie-Brilliantblau angefärbt werden um sichtbar zu werden
Isoelektrische Fokussierung
- Proteine wandern an ihrem IEP nicht durch ein elektrisches Feld
- Proteine werden in ein Trägermaterial mit pH-Gradienten gegeben und wandern im elektrischen Feld hin und her bis zu ihrem IEP –> “Fokussierung” sorgt für hohe Trennschärfe
- pH- Gradient: entweder im elektrischen Feld frei bewegliche Trägerampholyte (in Gel enthalten, heterogenes Synthesegemisch aus mehreren hundert verschiedenen, aliphatischen, niedermolekularen Oligoamino-Oligocarbonsäuren, die sich in ihrem IEP unterscheiden und in einem elektrischen Feld bis zu ihrem IEP wandern) oder Immobilien (kovalent mit dem Trägermaterial verbundene Ladungsträger)
- anodische Seite des Gels ist sauer, kathodische ist basisch
- kann analytisch oder präparativ verwendet werden und mit SDS-PAGE kombiniert werden
Praktikumsbeispiel - Elektrophorese
SDS-PAGE
Eichkurve erstellen mit Proteinstandard (Abstand der Proteinbande zur Oberkante messen und Werte in ein Diagramm eintragen –> gerade oder leicht sigmoide Kurve entsteht –> molekulare Masse eines unbekannten Proteins lässt sich dann aus der Eichkurve berechnen
Im Praktikum unbekanntes Protein anhand der Laufstrecke mithilfe einer Eichkurve identifizieren
Kapillarelekrophorese (CE) Aufbau
- CE ist zeitsparend, weil man größere Feldstärken anlegen kann
- Komplementärmethode zur HPLC: zeitsparend, hohe Auflösung, kleine Probenmengen
Aufbau:
- mit Elektrolyt gefüllte Kapillare mit den Enden in zwei mit Elektrolyt gefüllten Gefäßen
- Hochspannung über die Elektrolytgefäße zugeführt (bis zu 30 kV)
- Kapillare: fused-silica Kapillare, 20-100 cm lang, 50-250 um Durchmesser, mit Polyimid beschichtet für Stabilität der Kapillare –> vor der Verwendung in den Polyimidfilm ein Fenster kratzen, damit dadurch mit UV delektiert werden kann
- Detektoren: UV, Fluoreszenz, induktive Leitfähigkeit, elektrochemische und radioaktive
- Kombination mit MS schwierig, weil bei CE mit sehr geringen Flüssigkeitsmengen gearbeitet wird
- läuft meistens mit wässrigen Puffersystemen, selten auch mit Polyacrylamidgelen oder Immobilingelen in der Kapillare
Kapillarelektrophorese - Injektion
für die Probeninjektion Elektrolytgefäß am Kapillareneingang durch Probengefäß austauschen
- hochdynamisch: Druck am Eingang oder Vakuum am Ausgang der Kapillare zieht die Probe in die Kapillare
- elektrokinetisch: Hochspannung am Probengefäß anlegen –> Probe wandert elektrophoretisch und elektroosmotisch in die Kapillare
Kapillarelektrophorese - Ablauf
nach Injektion Probengefäß wieder mit Elektrolytgefäß austauschen und Elektrophorese-Spannung anlegen
- Spannung verursacht Trennung und Wanderung der ionischen Analyten und den elektroosmotischen Fluss
- EOF: Silanolgruppe in Quartzglas liegt bei der Analyse (pH 4-10) als Anion vor (innere Kapillaroberfläche negativ) –> Kationen aus der Lösung lagern sich an der Wand an (durch elektrostatische WW fixiert –> starre Schicht) –> daran anschließend bildet sich eine diffuse Doppelschicht mit Potenzialunterschied (Zeta-Potenzial) –> positive Aufladung der “Flüssigkeitssäule” –> Lösung wird Richtung Kathode “gepumpt” –> einheitlicher Fluss mit kolbenförmig radialem Strömungsprofil –> in der CE ein flaches Strömungsprofil mit sehr scharfen Banden
- zur Bewegung des Analyten wird die EOF dazuaddiert –> Analysezeiten für Kationen verkürzt, für Anionen verlängert oder sogar deren Bewegungsrichtung umgekehrt
- ausschlaggebend für die Trennung sind die verschiedenen Wanderungsgeschwindigkeiten von Ionen im elektrischen Feld
- elektrophoretische Mobilität: Stoffkonstante, für einen Stoff in einem bestimmten Medium bei einem bestimmten pH definiert –> kleinere Moleküle haben eine höhere Mobilität als größere
verschiedene Trennprinzipien in der CE: Kapillarzonenelektrophorese, Kapillargelelektrophorese, Kapillar-isoelektrische Fokussierung, Kapillaraffinitätselektrophorese
Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
- Probenauftragung als möglichst schmales Band (ergibt dann nach der Elektrophorese im Idealfall reine Zonen mit nur einer Komponente)
- Auftrennung aufgrund der Ladung und der Mobilität (neutrale Moleküle wandern zwar aufgrund des EOF, werden aber nicht aufgetrennt)
- Auflösung normalerweise gut –> Problem manchmal Elektrodispersion (führt zu Peakverbreiterung) –> Lösung: Puffer mit ähnlicher Mobilität wie die Analyten wählen
- pH großer Einflussfaktor: Dissoziationsgrad bestimmt Mobilität, EOF nimmt mit steigendem pH zu (kürzere Analysezeit, geringere Auflösung)
- Temperatur muss konstant sein für Reproduzierbarkeit
Bestimmung der relativen Aminosäurezusammensetzung
- Protein muss hierfür komplett hydrolysiert werden
- zu harte Bedingungen –> AS können zerstört werden (Cys, Trp, Ser, Met, Thr), zu milde Bedingungen –> keine vollständige Hydrolyse ==> 24h Dauer mit 6N HCl bei 110°C unter Sauerstoffausschluss
- Auftrennung dann mittels Ionenaustauschchromatographie mit Kationentauscher und pH-Gradienten
- Detektion: UV oder Fluoreszenz (z.B. durch Derivatisierung mit Ninhydrin –> Purpur, dient aber nur zur Quantifizierung, Identifizierung über die Retentionszeit)
- modernste Methode: reversed phase HPLC mit Derivatisierung der AS mit aromatischen Gruppen (werden dadurch hydrophober und ww besser mit der stationären Phase), mit UV detektierbar
- wenn man die relative AS-Zusammensetzung eines unbekannten Proteins kennt, dann helfen Datenbanken bei der Identifizierung (man sieht auch ob Glykoprotein oder nicht)
- wichtige Information für die gezielte Fragmentierung mit Proteasen
Wichtige “Meilensteine” in der Proteinanalytik
- Sangers: Reagenz zeigte, dass Proteine eine definierte AS-Abfolge haben und er klärte die Struktur des menschlichen Insulins auf –> Primärstruktur bestimmt dreidimensionale Struktur, ohne Kenntnis der AS-Abfolge keine 3D-Strukturanalyse möglich
- Röntgenkristallographie: Einblicke in die Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur von Proteinen (zuerst Myoglobin und später Hämoglobin)
Bestimmung der N-terminalen Aminosäure:
mit Sängers-Reagenz (1-Fluor-2,4-dinitrobenzol) oder Dansylchlorid
beide laufen ähnlich ab
mit Sangers Reagenz: terminale Aminogruppe greift Reagenz in einer nukleophilen aromatischen Substitution an –> Derivat, das im Sauren stabil ist –> Protein anschließend vollständig hydrolysieren und die N-terminale derivatisierte AS über Chromatographie identifizieren
heute aber fast nur noch Edman-Abbau verwendet
Edman-Abbau: Reaktionen
Kupplung:
- freie N-terminale AS reagiert mit Edman-Reagens (Phenylisothiocyanat = PITC) = PTC-AS –> Amin muss dafür unprotoniert vorliegen (basischer pH, ca. 9)
- bei zu hohem pH Reaktion zwar schneller, aber PITC hydrolasiert zu Anilin –> + PITC = Diphenylthioharnstoff –> Nebenprodukt
- nach der Reaktion mit umpolarem LM waschen (trennt Reagens ab, Peptid ist darin unlöslich), danach trocknen
Spaltung:
- mit wasserfreier Trifluoressigsäure behandeln: nucleophiler Angriff des Schwefels auf die Carbonylgruppe –> Ringschluss, AS wird abgespalten
- funktioniert nur mit Schwefel, Sauerstoff nicht nukleophil genug für Ringschluss –> Austausch Schwefel-Sauerstoff muss unterbunden werden, deshalb Schutzgas-Atmosphäre
Konvertierung:
- Säure wird abgedampft
- derivatisierte AS wird mit hydrophoben LM extrahiert (stark andere Löslichkeit als der Rest vom Peptid) –> muss danach wieder über Hydrolyse und erneutem Ringschluss zu PTH-AS konvertiert werden, weil nur diese stabil ist
- PTH-AS können dann über Chromatographie identifiziert und quantifiziert werden
verkürztes Peptid wird getrocknet und kann weiter mit Edman-Abbau gespalten werden, Ausbeute 95% –> nach jedem Schritt bleibt ein bisschen unverkürztes Peptid übrig, das ein Signal in der Chromatographie ergibt –> irgendwann so viele Signale, dass man die Spektren nicht mehr interpretieren kann –> umso höher die Ausbeute, desto geringer die Störsignale der unverkürzten Peptide, desto häufiger kann der Edman-Abbau hintereinander ablaufen, d.h. umso länger kann das zu analysierende Peptid sein (momentan schafft man es 30-40 AS so zu analysieren)
Edman-Abbau: Apparatur
früher: Flüssiggasen-Sequencer –> rotierender Becher mit Proteinprobe an der Wand –> wenig Flüssigkeit dazugegeben und nach der Reaktion abgesaugt; Nachteil: ein kleiner Teil des Proteins löst sich in der Flüssigkeit (löslich in Säure/Base) und wird so mit ausgewaschen
heute: Gasphasen-Sequencer
- Protein auf interne Glasfritte gegeben
- Säure/ Base werden nur gasförmig dazugegeben, Protein kann sich darin also nicht lösen: Inertgas wird zuerst durch Säure/Base geleitet und dann in die Reaktionskammer –> basische/saure Bedingungen in der Kammer ohne Flüssigkeit
- ATZ-Aminosäuren werden dann mit organischem LM extrahiert
Limit des Edman-Abbaus: funktioniert nicht, wenn die N-terminale AS modifiziert ist (lässt sich aber manchmal vorher chemisch entfernen
Spaltung von Proteinen vor der Sequenzierung
vor der Sequenzierung müssen Proteine > ca. 7 kDa in kleinere Fragmente gespalten werden –> Enzyme helfen
- verschiedene Enzyme werden eingesetzt, um verschiedene überlappende Fragmente zu erhalten, deren Sequenzen später zur Primärstruktur zusammengefügt werden können
- Endoproteinase LsyC spaltet nach Lys (C-seitig): durchschn. Länge der erhaltenen Fragmente 16 AS
- Endoproteinase AspN spaltet vor Asp (N-seitig): durchschn. Länge der Fragmente 18 AS
- Bromcyan spaltet bei Met (dafür gibt es kein Enzym): Met relativ selten, deshalb durchschn. Länge 38 AS
- Trypsin spaltet nach Lys und Arg: durchschn. Länge 9 AS
- wichtige Parameter bei der Spaltung: Puffer, ph-Wert, Temperatur, Verhältnis Protein/Protease, Reaktionszeit
