VO 4

Question 1

Magnetische Resonanzspektroskopie (NMR)

Answer 1

• zusammen mit Röntgenkristallographie die einzige Möglichkeit, die 3D-Struktur von Proteinen auf dem atomaren Level zu analysieren –> komplementär (einmal in Lösung, einmal als Kristall gemessen)
• in Lösung kann man Protein-Faltung Reaktionen etc. beobachten unter relativ - für das Protein - natürlichen Bedingungen
• Limit: wegen relativ geringer Empfindlichkeit und sehr komplexen und hoch informativen Spektren bei 30 kDa
• detektierbare, für Biomoleküle relevante Kerne: 1H, 13C, 15N, 31P (15N kann man anreichern, 31P liegt zu 100% vor, O nicht geeignet weil 16O falsche Spinzahl und 17O zu selten
• Anreicherung der detektierbaren Isotope: Protein in Bakterien herstellen, Nährmedium enthält aber z.B. nur 15N und/oder 13C
• H2O durch D2O ersetzt –> denaturierte Proteine
• Protein muss für NMR hoch aufgereinigt und isoliert vorliegen
• rekombinante Proteine: Vorteil große Mengen und Isotopenanreicherung
• meistens in Wasser oder wässrigem Puffer (kleiner Teil D2O als Locksignal)
• Primärstruktur muss bekannt sein

Question 2

1H-NMR (Spektrum)

Answer 2

• Rückgrat-Amid-Protonen, -NH von Arg, -NH2 von Lys, Asn, Gln und aromatische Protonen: 8 ppm
• eindimensional: viele Signale überlappen (Informationsgehalt stark limitiert)

Question 3

mehrdimensionale NMR-Experimente

Answer 3

• zusätzliche Dimensionen erhöhen Informationsgehalt und verringern die Wahrscheinlichkeit, dass Signale überlappen
• Kopplungen der einzelnen Kerne werden sichtbar (indirekte bei Bindungen, direkte durch den Raum)
• 1D-Spektrum –> eine Frequenzachse (bzw. chemische Verschiebung) und eine Intensitätsachse, bei 2D zwei Frequenzachsen usw.
• Pulssequenz überträgt Magnetisierung über chemische Bindung oder über den Raum auf andere Kerne; gleiche Kernsorte (homenuklear), andere Kernsorte (heteronukelar, z.B. 1H und 13C)
• nicht-Isotopen-angereicherte Proteine bis 10 kDa: 1x COSY, 1x TOCSY, 1x NOESY/ROESY für vollständige Analyse notwendig

Question 4

2D-NMR

Answer 4

• Aufnahme 1D-Spektrum: sofort nach dem Impuls FID aufnehmen –> Spektrum mit chemischer Verschiebung gegen Intensität aufgetragen
• Aufnahme 2D-Spektrum: Evolutionspuls + mehrere weitere Impulse, Zeit zwischen den Impulsen wird vor jedem Impuls um die gleiche Spanne erhöht (im ms Bereich) –> Serie an 1D-Spektren entsteht
• jeder Punkt auf den 1D-Spektren, die an gleicher Stelle im Spektrum sitzen, werden zusammengefasst und nochmal Fourier-transformiert –> 2D-Frequenzespektrum entsteht
• Darstellung:
  
  • gestaffeltes Diagramm
  • Kurvendiagramm (praktischer, häufiger angewendet), beide Achsen zeigen chemische Verschiebung, Intensität durch Größe der Konturen dargestellt

Question 5

COSY (correlation spectroscopy)

= 2D-NMR

Answer 5

• Darstellung der auf der skalaren Spin-Spin-Kopplung beruhenden Beziehungen zwischen Kernen
• heteronukleare Spektren (z.B. C,H-COSY)
• homonukleare Spektren (z.B. H,H-COSY)
• H,H-COSY: Informationen über geminale (über 2 Bindungen) und vicinale (über 3 Bindungen) H-H-Kopplungen
• einfachste Form: nur zwei Impulse (90° gedreht) mit Zeitabstand t1
• auf beiden Achsen 1H-chemische Verschiebung aufgetragen
• zwei unterschiedliche Signaltypen:
  
  • Diagonalsignale: für die Auswertung nicht relevant
  • Kreuzsignale: relevant
• jede skalare Kopplung hat 4 Signale (2x diagonal, 2x kreuz) –> ergeben ein Quadrat

Question 6

TOCSY (total correlation spectroskopy)

Answer 6

• Magnetisierungstransfer deutlich weiter als bei COSY (entlang des ganzen Spinsystems)
• Spinsystem: kontinuierliche Kette von Protonen, die an benachbarten Kernen verbunden sind, z.B. jede einzelne AS in eine Protein
• Magnetisierungstransfer nur innerhalb einer AS möglich, da durch Carbonyl-C unterbrochen
• keine Aussage über die Reihenfolge der Kopplungen möglich (sieht man iim COSY), Intensitäten sind bedeutungslos
• jede AS hat charakteristisches Muster (Identifizierung z.T. darüber möglich, wenn CH2 in der Seitenkette, dann nicht mehr zwingend eindeutig)

Question 7

HSQC (heteronuclear single quantum correlation)

HMQC (heteronuclear multiple quantum correlation)

Answer 7

• führen zu einer drastischen Verkürzung der Messzeit bei Aufnahme von C- oder N-Spektren
• auf dem Kanal der unempfindlichen Kerne (C, N) werden Kohärenzen erzeugt, die dann auf empfindlichere Kerne (meistens 1H) übertragen werden und deren Resonanz dann gemessen wird
• Spektren meistens sehr übersichtlich (nur Kreuzsignale von direkt gebundenen C/N und H) –> im Prinzip Zusammensetzung eines 1H-NMR-Spektrums und eines breitbandentkoppelten C/N-NMR-Spektrums
• wenn Probe 15N angereichert wurde, meist die erste NMR-Messung ein 15N-HSQC –> zeigt alle Rückgrat-N und alle Seitenketten-N auf –> sind alle erwarteten Signale vorhanden? wenn nein, wo liegt der Fehler? –> wenn das Spektrum den Anforderungen entspricht, werden die anderen (teureren) NMR-Spektren erstellt (HSQC reicht nicht für die Bestimmung, muss kombiniert mit anderen NMR gemacht werden)
• x-Achse: chemische Verschiebung 1H; y-Achse: chemische Verschiebung 13C/15N

Question 8

HMBC (heteronuclear multiple band correlation)

Answer 8

• Korrelationen über mehrere Bindungen werden sichtbar
• eine der empfindlichsten aller NMR-Methoden
• Impulsfolge (im xten und im Protonenkanal): 90°- und 180°-Impulse durch Zeit t und t1 getrennt
• x-Achse: chemische Verschiebung 1H; y-Achse: chemische Verschiebung 13C/15N –> im Prinzip Zusammensetzung eines 1H-NMR-Spektrums und eines breitbandentkoppelten C/N-NMR-Spektrums
• Auswertung meistens mit Tabellen

Question 9

NOESY (nuclear overhauser effect spectroscopy)

ROESY (rational nuclear overhauser effect spectroscopy)

Answer 9

• Magnetisierungstransfer über den Raum durch den Kern-Overhauser-Effekt (NOE)
• Intensität der Signale umgekehrt proportional zum Abstand^6
• nur beobachtet, wenn der Abstand weniger als 5 Å ist
• NOE- Faktoren können positiv oder negativ sein (Achtung bei Nulldurchgang können Signale übersehen werden) –> ROESY vermeidet diesen Fehler
• wichtig für die Strukturbestimmung: erlaubt die Reihenfolge der Spinsysteme aus COSY und TOCSY zu erkennen –> bei NOESY erhält man Signale bei räumlicher Nähe unabhängig ob im gleichen Spinsystem oder eben nicht

Question 10

Von NMR-Signalzuordnung zur 3D-Struktur

Answer 10

• seqenzspezifische Zuordnung der NMR-Signale zu den entsprechenden Aminosäuren aufgrund ihrer Wechselwirkungen mit den benachbarten Aminosäuren
• TOCSY: Identifizierung der einzelnen Spinsysteme (=AS)
• COSY: Zuordnung einzelner Signale zu den jeweiligen Protonen
• Identifikation einzelner AS aufgrund ihres charakteristischen Signalmusters (Gly, Ala, Val, Ile)
• Nachbarschaft anhand des NOESY-Signals von backbone-NH zu den Hs der benachbarten AS erkennbar –> “sequential walk”

Berechnung der 3D-Struktur (man benötigt strukturrelevante Daten aus NMR):

• Abstände aus NOESY
• Dihedralwinkel über J-Kopplungen und chemische Verschiebungen
• -> anschließend wird die Struktur über eine Software berechnet (+ “Kraftfeldparameter” = Moleküldaten aus Referenz-Molekülen
• Qualität und Quantität der Daten bestimmen die Qualität des 3D-Modells
• oftmals Vergleich des Modells mit Röntgenkristallographie zur Verifizierung
• es können Teile des Proteins beweglich sein –> verschiedene Konformationen

man kann auch zeitabhängige Phänomene (Ligand-Bindung, Proteinfaltung etc.)