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Bioanalytische Methoden in der pharmazeutischen Chemie > VO 1 > Flashcards

VO 1 Flashcards

1
Q

Was ist Bioanalytik?

A
  • beschreibt analytische Methoden, mit denen biologische Proben untersucht werden können (meist biologische Makromoleküle und deren Veränderungen), können Proteine, DNA, RNA, Kohlenhydrate, Lipide oder anderes sein
  • in der Pharmaforschung: Wirkstoffe, Metaboliten und Antikörper in Gewebe und Flüssigkeiten quantifizieren, um LADME zu verstehen
  • früher/manchmal heute noch: biologisches Phänomen wird auf ein Protein zurückgeführt, dieses wird dann analysiert um das Phänomen zu verstehen
    heute: biologisches System wird als Ganzes betrachtet

Biologische Probe –> Proteinanalytik, Nukleinsäurenanalytik, Analytik spezieller Stoffgruppen ==> Strukturinformation, Funktionsinformation
Systemische Funktionsanalytik –> Strukturinformation, Funktionsinformation ==> biologisches System verstanden

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2
Q

Protein Definition

A

hochmolekularer, aus Aminosäuren aufgebauter Naturstoff

3D-Struktur essentiell für die Funktion

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3
Q

Peptid Definition

A

organische Verbindung, die aus 2 bis ca. 100 Aminosäuren aufgebaut ist (oft sind das Hormone oder Neurotransmitter)

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4
Q

Proteom Definition

A

Gesamtheit aller Proteine in einer Zelle/ einem Gewebe/ einem Lebewesen zu einem bestimmten Zeitpunkt unter exakt definierten Bedingungen

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5
Q

Was man von einem Protein wissen will

A
  • Sequenzanalyse
  • Bestimmung posttransnationaler Modifikationen
  • 3D-Struktur
  • Einblick in molekulare Mechanismen der Protein-Aktion

Isolation schwierig, man möchte gute Ausbeuten unter Erhalt der biologischen Funktion
Nach Aufreinigung meistens spektroskopisch, immunologisch und enzymatisch untersucht

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6
Q

Funktionelle Rolle von Proteinen

A
  • enzymatische Katalyse
  • Transport und Speicherung
  • koordinierte Bewegung
  • mechanische Stützfunktion
  • Immunabwehr
  • Erzeugung und Übertragung von Nervenimpulsen
  • Kontrolle von Wachstum und Differenzierung
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7
Q

Proteinogene Aminosäuren

A

AS, die Bestandteile von Proteinen sind
- immer alpha-AS in der L-Konfiguration

Standardaminosäuren (kanonische AS, in der Standardversion des genetische Codes codiert, 20 Stk):
- klein: Glycin, Alanin
- nucleophil: Serin, Threonin, Cystein
- Hydrophob: Valin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Prolin
- Aromaten: Phenylalanin, Tyrosin, tryptophan
- sauer: Asparaginsäure, Glutaminsäure –> bei basischem pH negativ geladen –> Protein zeigt anionischen Verhalten
- Amide: Asparagin, Glutamin
- basisch: Histidin, Lysin, Arginin –> bei saurem pH proponiert –> Protein zeigt kathionisches Verhalten
gibt auch nicht-kanonische proteinogene AS

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8
Q

AS = Zwitter-Ionen

A
  • basisch wegen Aminogruppe, sauer wegen Carboxylgruppe
  • in neutralen Lösungen als Zwitterionen: können als Protonendonor = Säure (NH3) oder Akzeptor = Base (COOH) reagieren
  • im Sauren immer kathionsch, im Basischen immer anionisch
  • isoelektrischer Punkt = pH, bei dem Nettoladung des Proteins null; variiert wegen unterschiedlich saurer oder basischer Seitenketten
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9
Q

Primärstruktur

A

Sequenz der Aminosäuren

  • Schreibweise: N-Terminus links anfangen, C-Terminus rechts aufhören (1- oder 3- Buchstaben-Code)
  • in der DNA codiert, in den Ribosomen die Reihenfolge aus der DNA in Peptidbindungen umgesetzt
  • Primärstruktur gibt keine Aussage zur Funktion, erst 3D-Faltung in wässrigem Milieu gibt Ausschluss über biologische Funktion
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10
Q

Sekundärstruktur

A

räumlichen Anordnung der Aminosäuren

  • häufige Strukturen: alpha-Helix, beta-Faltblatt, beta-Schleife, beta-Helix
  • Struktur ergibt sich aus H-Brücken zwischen den Peptidbindungen des Polypeptid-Rückgrates
  • charakteristischer Winkel jeder AS zum Rückgrat: Diederwinkel
  • Ramachandran-Plot: alle Winkel vor (N-terminal) und nach (c-terminal) dem C im Rückgrat werden nummeriert und aufgetragen und aus dem Plot kann man dann die Sekundärstrukturen ablesen
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11
Q

Tertiärstruktur

A

räumliche Anordnung der Porlypeptidkette

  • WW und Bindungen zwischen den Seitenketten der AS
  • Disulfidbrücken, H-Brücken, hydrophobe und ionische WW, VdWWW
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12
Q

Quartärstruktur

A

Komplexbildung mehrerer Proteine für die Funktionsfähigkeit

  • können unterschiedliche Proteine sein oder mehrere gleiche
  • durch H-Brücken oder Salzbrücken zusammengehalten, aber auch kovalente Bindungen
  • Bsp: Immunglobuline, zwei gleiche schwere und zwei gleiche leichte Ketten über Disulfidbrücken zusammengelagert
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13
Q

Posttranslationale Modifikationen (PTMs)

A

Veränderung des Proteins nach der Translation
- Abspaltungen (z.B. Proinsulin)
- Modifizierungen mit anorganischen Gruppen (Phosphorylierungen, Sulfatierung, Nitrierung, …)
- Modifizierungen mit organischen Gruppen (Formulierung, Glykosydierung, Acetylierung, …)
- Bindung an größere Moleküle
- Hinzufügen von Bindungen
uvm.

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14
Q

Quantitative Bestimmung durch Färbetests

A
  • genaueste Methode zur Bestimmung des Proteingehalts: Protein aus wässriger Lösung gefrieren und dann abwiegen
  • oft aber Färbereaktionen oder Spektroskopie ausreichend (ACHTUNG! Störfaktoren)
  • Farbreaktionen mit bestimmten funktionellen Gruppen in den Seitenketten oder mit dem Peptidrückgrat (weiteres wesentlich genauer)
  • immer Mehrfachbestimmungen (mind. 3) und Blindprobe machen
  • nur für einen bestimmten Konzentrationsbereich linear (umso mehr Protein, desto deutlicher gefärbt), Probe ggf VOR der Färbereaktion verdünnen
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15
Q

Biuret-Farbereaktion

A

Reaktion mit Kupfersulfat im alkalischen wässrigen Milieu

  • Peptidbindungen komplexieren Cu2+ –> rotviolette Färbung
  • Tyrosin reagiert auch mit Cu2+ –> kann die Farbe intensivieren und das Ergebnis verfälschen
  • störend wirken Ammonium, Reduktion- und Oxidationsmittel
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16
Q

Lowry-Farbreaktion

A

Kupfer-Protein-Komplex wie bei Biuret, anschließende Reduktion von Molybdat oder Wolframat durch Tyr, Trp, Cys, His im Peptid –> Cu2+ wird zu Cu+ –> zusätzliche Farbreaktion

  • erhöht die Sensitivität ggüber nur Biuret
  • störend wirken EDTA, Ammoniumsulfat, Triton X-100
17
Q

Bicinchorinsäure (BCA)-Farbreaktion

A

Biuret + BCA

- ebenfalls Cu2+ zu Cu+ reduziert –> BCA bildet mit Cu+ einen Farbkomplex

18
Q

Bradford-Test

A
  • einziger Farbtest ohne Cu-Ionen
  • Coomassie-Brilliantblau G250 –> Absorptionsmaximum verschiebt sich in Anwesenheit von Proteinen im sauren Milieu
  • einfachster und empfindlichster Test
  • aber auch “subjektivster” –> Reaktion mit funktionellen Gruppen (Arg, z.T. Lys, His, Trp, Tyr, Phe) in den Seitenketten kann das Ergebnis verzerren
19
Q

Spektroskopische Methoden

A
  • sind im Vergleich zu Farbreaktionen unempfindlicher und benötigen höhere Proteinkonzentrationen
  • UV-Absorption von aromatischen AS: ungenau, da nicht jedes Peptid gleich viele aromatische AS enthält (z.B. Trp wird bei 279 nm gemessen, Gehalt in verschiedenen Proteinen kann stark variieren)
  • UV-Absorption der Peptidbindung: unabhängig von AS-Zusammensetzung, aber manche AS oder Puffer haben Absorption im gleichen Bereich und können so stören/ verfälschen
  • Eigenfluoreszenz von Trp: man muss eine Kalibiergerade aufnehmen können, Anregung bei 280 nm, Emission bei 320-350 nm gemessen, nur bei sehr sauberen Lösungen möglich, Phe hat kauf Fluoreszenz, Trp wird gequentcht
20
Q

Eigenschaften von Proteinen

A
  • größere Proteine lassen sich schwerer isolieren und analysieren als kleinere
  • kleine Proteine: chromatographisch trennen; größere: elektrophoretisch trennen
  • selektive Reinigungstechniken: hochselektiv aber schlechte Trennkapazität (z.B. Affinitätschromatographie)
  • hydrophobe Proteine (v.a. Membranproteine) können oft nur mit Detergenzien unter Denaturierung getrennt werden (würden ohne Zusätze im wässrigen aggregierten und ausfallen)
  • überexprimierte Proteine oder in großen Mengen vorhanden wesentlich leichter zu isolieren
  • Säure-Base-Eigenschaften der Proteine oft für die Trennung genutzt, Ladung hängt vom pH ab (niedriger pH = positiv, hoher pH = negativ)
  • Reinigung dadurch erschwert, dass Unterscheidung manchmal nur durch biologische Aktivität möglich ist, diese aber oft verloren geht bei der Reinigung (Denaturierung etc.), Denaturierung ist fast immer irreversibel !
  • Proteine außerhalb ihres biologischen Milieus oft instabiler
  • weitere Probleme: Abbau durch Proteinen (können durch Protease-Inhibitoren gehemmt werden vor der Isolierung) oder es entstehen unlösliche Aggregate
  • Reinigung allgemein schnell und bei niedrigen Temperaturen durchführen
21
Q

Zielsetzung einer Proteinreinigung

A
  • es gibt keine schematische Vorschrift - jede Reinigung ist ein Einzelfall
  • Reinigungsschritte hängen von der Zielsetzung ab (Sequenzanalyse? Soll biologische Funktion vorhanden bleiben? etc.)
  • grobe Vorgehensweise: Vorreinigung (Matrixkomponenten abtrennen) –> Fraktionierung (chromatographisch) —> Feinreinigung

Vorgehen bei einer Sequenzanalyse:

  • geringe Menge an Protein ausreichend
  • Sequenzinformation ermöglicht Herstellung von Oligonukleotid-Sonden und Isolation des Gens des Proteins (wird in Gasorganismen dann für weitere Analysen in viel größerer Menge exprimiert –> im Gramm Maßstab)
  • bei der rekombinanten Synthese in Wirtsystemen können Tags eingeführt werden (z.B. z.B, His-Tag –> 6x Histidin –> komplexiert mit Nickel, wird zur Isolierung verwendet); Tags erlauben Reinigungskontrolle, die nicht für jedes Protein neu optimiert werden muss
  • Feinreinigung dann mit Elektrophorese oder Chromatographie (abhängig von der zur Verfügung stehenden Menge)

Proteom-Analyse: Die Verhältnisse der Proteine dürfen nicht verändert werden, aber der Erhalt der biologischen Funktion ist nicht so wichtig

22
Q

Allgemeine Vorgehensweise bei der Reinigung/Isolierung

A
  • extrazelluläre Proteine: bereits gelöst in wässrigem Milieu, Abtrennen der unlöslichen Teile und Aufkonzentrieren ausreichend
  • intrazelluläre Proteine: Zellaufschluss
    • Membranproteine: Isolierung der entsprechenden Membranfraktion –> leichter sind periphere Proteine (milde Bedingungen ausreichend: hoher pH, EDTA dazu), am schwierigsten integrale Proteine zu isolieren (sehr Hydrophobie, agggregieren gerne in Wasser, viel Detergenzien benötigt
    • Strukturproteine: oft über PTMs quervernetzt –> zuerst lösliche Proteine abtrennen, dann Quervernetzung auflösen, dann Rest isolieren –> Protein denaturiert meistens
    • Gesamt-Proteine: Fällung mit Salzen oder organischen LM (Hofmeister-Serie)
  • Zentrifugation: zur Abtrennung von unlöslichen Bestandteilen, Isolierung von Zelorganellen etc.
    • Ultrazentrifugation im Vakuum um Widerstand zu reduzieren
    • Differentielle Zentrifugation: Sedimentationsgeschwindigkeit ausreichend unterschiedlich (z.B. Zellkerne - Mitochondrien), kann auch zum Aufkonzentrieren verwendet werden
    • Zonenzentrifugation: Sedimentationsgeschwindigkeit nicht ausreichend unterschiedlich –> Dichte- oder Viskositätsgradient im Medium
  • Abtrennung von Salzen (z.B. wenn Pufferzusammensetzung oder Ionenstärke für den nächsten Reinigungsschritt ungeeignet): Dialyse, Ultrafiltration, Gelchromatographie
    • Ultrafiltration: verwendet Membran, die für kleine Salzmoleküle durchlässig ist (Dialyse auch), Einweg-Gefäße mit Membran in einer Zentrifuge, auch geeignet zum Aufkonzentrieren und Entfernen von Detergenzien
    • Dialyse: regenerierte Zellulosemembran (vor Gebrauch gut spülen) –> Probe in Dialyseschlauch füllen, Schlauch dann in Gefäß mit Puffer oder Wasser geben, Puffer nach 4-6h austauschen (GGW hat sich dann eingestellt und es diffundiert kein Salz mehr aus dem Schlauch)
  • spezielle Methoden zum Abtrennen von Detergenzien: als letzter Schritt, weil dort hydrophobe Proteine nicht mehr in Lösung bleiben
23
Q

Dialyse - Praktikumsbeispiel

A
  • im Praktikum beispielhaft um die Plasmaproteinbindung eines Arzneistoffs zu analysieren (prozentuale Plasmaeiweißbindung eines unbekannten Sulfonamids
  • freies Sulfonamid diffundiert aus dem Dialyseschlauch in die Pufferlösung
  • Sulfonamid-Eiweiß-Komplex löst sich, um im Schlauch wieder GGW von gelöstem und gebundenem Sulfonamid herzustellen, gelöstes wird aber kontinuierlich weggenommen
  • Dialyse wird nach 24h gestoppt und die Konzentration des Sulfonamids photometrisch bestimmt –> Diazokopplung mit Bariton-Marshall-Reagenz (ergibt farbige Azoverbindung, deren Extintion bei 546 nm gemessen werden kann (zuerst Kalibriergerade erstellen !!)
24
Q

Chromatographische Trennmethoden für Proteine:

Moleküleigenschaft –> Trennmethode

A
  • Größe, Form –> Ausschluss
  • Ladung –> Ionenaustausch
  • Biospezifität –> Affinität
  • Komplexierung –> Metallchelate
  • Hydrophobizität –> Hydrophobie WW (reversed phase: hydrophobe stationäre Phase)
25
Q

Gelchromatographie

A
  • Gelfiltrationschromatographie = wässrig (nur diese für Proteine relevant)
  • Gelpermeationschromatographie = organische LM
  • Trennung aufgrund unterschiedlicher Permeation in einem porösen Trägermedium mit definierter Porengröße
  • kleine Moleküle dringen in die Poren, bleiben länger drin als größere Moleküle, werden später eluiert und detektiert
  • zur Fraktionierung von Proteinen oder Abtrennung niedermolekularer Bestandteile (z.B. Salze)
  • Probe immer verdünnt auftragen
  • kaum/keinen Einfluss auf das Trennverhalten
26
Q

Gelchromatographie - Praktikumsbeispiel

A

Trennung von Dextranblau (2 Mio g/mol) und Vitamin B12 (Cobalamin, 1355 g/mol)

  • Detranblau –> blau wegen Cibachonblau an Dextran
  • Cobalamin –> rot wegen Anregung der d-Elektronen im Cobalt
  • Trenngel: Sephadex G 15 (Moleküle mit bis zu 1500 g/mol können in die Poren eindringen)
  • mobile Phase: Wasser
  • Messung der Extraktion von Vitamin B12 bei 361 nm
27
Q

Ionenaustauschchromatographie

A 
Anionenaustauscher:
- quarternäre Hydroxypropyldiethylaminoethylgruppen (QAE)
- quarternäre Trimethylaminoethylgruppen (Q)
- Diethylaminoethylgruppen (DEAE)
Kationenaustauscher:
- Sulfonmethylgruppen (S)
- Sulfopropylgruppen (SP)
- Carboxylmethylgruppen (CM)
  • Protein je nach pH und AS mit Seitenketten und PRMs sauer oder basisch, Tertiärstruktur gibt die Ladungsverteilung an der Oberfläche vor
  • pH für die IAC möglichst weit weg vom IEP wählen, damit Protein stark geladen ist und gut mir Ionenaustauscher wechselwirkt
  • Puffer so wählen, dass sowohl Protein als auch stationäre Phase ionisch vorliegen (entgegengesetzt geladen)
  • Bsp: DEAE bindet negative Proteine gut, positive und neutrale laufen durch
  • Eluation mit Puffer mit NaCL mit steigender Konzentration –> Cl (oder Na) konkurrieren mit Protein um Bindung am Austauscher –> irgendwann alle Proteine eluiert
  • alternativ über pH-Gradienten beim Eluieren: Protein wird weniger stark ionisch, bindet schwächer/ nicht mehr an Austauscher und wird ausgespült
  • sehr leistungsstarkes Trennverfahren, Protein wird dabei aufkonzentriert
28
Q

Affinitätschromatographie

A
  • nutzt das spezielle, reversible Bindungsvermögen von komplementären Molekülen (z.B. Antigen/Antikörper, Glykoproteine/Lektine, Enzyme/Coenzyme)
  • synthetisch zugänglicher Partner wird an Matrix immobilisiert (= stationäre Phase)
  • gewünschter Partner wird aus komplexem Gemisch gebunden –> gut waschen –> Partner wird wieder eluiert (z.B. durch pH-Änderung –> Konformationsänderung –> WW kommen nicht mehr zustande)
  • Bsp: Glykoproteine von Lektinsäule eluieren auch möglich mit Zucker als kompetitivem Liganden
  • gruppenspezifische Liganden (z.B. Lektin/Glykoproteine) oder monospezifische (Antikörper/Antigen)
  • stationäre Phase fertig zu kaufen oder selber aus aktiviertem Gel und aktiviertem Liganden zusammenstellen
29
Q

Affinitätschromatographie - Metallchelate

A
  • Nickel-Chelat-Chromatographie
  • viel verwendet in der rekombinanten DNA-Technologie
  • His6-Tag bildet Komplex mit Ni2+ (gebunden an Nitriloessigsäure in Sepharose) –> ein Ni2+ wechselwirkt mit 2 His
  • Eluation mit Imidazol-Gradienten oder über pH-Änderung (pH-Änderung kann aber zur Denaturierung der Proteine führen, wenn diese sehr empfindlich sind)

Bioanalytische Methoden in der pharmazeutischen Chemie (7 decks)

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