VO 1 Flashcards
Was ist Bioanalytik?
- beschreibt analytische Methoden, mit denen biologische Proben untersucht werden können (meist biologische Makromoleküle und deren Veränderungen), können Proteine, DNA, RNA, Kohlenhydrate, Lipide oder anderes sein
- in der Pharmaforschung: Wirkstoffe, Metaboliten und Antikörper in Gewebe und Flüssigkeiten quantifizieren, um LADME zu verstehen
- früher/manchmal heute noch: biologisches Phänomen wird auf ein Protein zurückgeführt, dieses wird dann analysiert um das Phänomen zu verstehen
heute: biologisches System wird als Ganzes betrachtet
Biologische Probe –> Proteinanalytik, Nukleinsäurenanalytik, Analytik spezieller Stoffgruppen ==> Strukturinformation, Funktionsinformation
Systemische Funktionsanalytik –> Strukturinformation, Funktionsinformation ==> biologisches System verstanden
Protein Definition
hochmolekularer, aus Aminosäuren aufgebauter Naturstoff
3D-Struktur essentiell für die Funktion
Peptid Definition
organische Verbindung, die aus 2 bis ca. 100 Aminosäuren aufgebaut ist (oft sind das Hormone oder Neurotransmitter)
Proteom Definition
Gesamtheit aller Proteine in einer Zelle/ einem Gewebe/ einem Lebewesen zu einem bestimmten Zeitpunkt unter exakt definierten Bedingungen
Was man von einem Protein wissen will
- Sequenzanalyse
- Bestimmung posttransnationaler Modifikationen
- 3D-Struktur
- Einblick in molekulare Mechanismen der Protein-Aktion
Isolation schwierig, man möchte gute Ausbeuten unter Erhalt der biologischen Funktion
Nach Aufreinigung meistens spektroskopisch, immunologisch und enzymatisch untersucht
Funktionelle Rolle von Proteinen
- enzymatische Katalyse
- Transport und Speicherung
- koordinierte Bewegung
- mechanische Stützfunktion
- Immunabwehr
- Erzeugung und Übertragung von Nervenimpulsen
- Kontrolle von Wachstum und Differenzierung
Proteinogene Aminosäuren
AS, die Bestandteile von Proteinen sind
- immer alpha-AS in der L-Konfiguration
Standardaminosäuren (kanonische AS, in der Standardversion des genetische Codes codiert, 20 Stk):
- klein: Glycin, Alanin
- nucleophil: Serin, Threonin, Cystein
- Hydrophob: Valin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Prolin
- Aromaten: Phenylalanin, Tyrosin, tryptophan
- sauer: Asparaginsäure, Glutaminsäure –> bei basischem pH negativ geladen –> Protein zeigt anionischen Verhalten
- Amide: Asparagin, Glutamin
- basisch: Histidin, Lysin, Arginin –> bei saurem pH proponiert –> Protein zeigt kathionisches Verhalten
gibt auch nicht-kanonische proteinogene AS
AS = Zwitter-Ionen
- basisch wegen Aminogruppe, sauer wegen Carboxylgruppe
- in neutralen Lösungen als Zwitterionen: können als Protonendonor = Säure (NH3) oder Akzeptor = Base (COOH) reagieren
- im Sauren immer kathionsch, im Basischen immer anionisch
- isoelektrischer Punkt = pH, bei dem Nettoladung des Proteins null; variiert wegen unterschiedlich saurer oder basischer Seitenketten
Primärstruktur
Sequenz der Aminosäuren
- Schreibweise: N-Terminus links anfangen, C-Terminus rechts aufhören (1- oder 3- Buchstaben-Code)
- in der DNA codiert, in den Ribosomen die Reihenfolge aus der DNA in Peptidbindungen umgesetzt
- Primärstruktur gibt keine Aussage zur Funktion, erst 3D-Faltung in wässrigem Milieu gibt Ausschluss über biologische Funktion
Sekundärstruktur
räumlichen Anordnung der Aminosäuren
- häufige Strukturen: alpha-Helix, beta-Faltblatt, beta-Schleife, beta-Helix
- Struktur ergibt sich aus H-Brücken zwischen den Peptidbindungen des Polypeptid-Rückgrates
- charakteristischer Winkel jeder AS zum Rückgrat: Diederwinkel
- Ramachandran-Plot: alle Winkel vor (N-terminal) und nach (c-terminal) dem C im Rückgrat werden nummeriert und aufgetragen und aus dem Plot kann man dann die Sekundärstrukturen ablesen
Tertiärstruktur
räumliche Anordnung der Porlypeptidkette
- WW und Bindungen zwischen den Seitenketten der AS
- Disulfidbrücken, H-Brücken, hydrophobe und ionische WW, VdWWW
Quartärstruktur
Komplexbildung mehrerer Proteine für die Funktionsfähigkeit
- können unterschiedliche Proteine sein oder mehrere gleiche
- durch H-Brücken oder Salzbrücken zusammengehalten, aber auch kovalente Bindungen
- Bsp: Immunglobuline, zwei gleiche schwere und zwei gleiche leichte Ketten über Disulfidbrücken zusammengelagert
Posttranslationale Modifikationen (PTMs)
Veränderung des Proteins nach der Translation
- Abspaltungen (z.B. Proinsulin)
- Modifizierungen mit anorganischen Gruppen (Phosphorylierungen, Sulfatierung, Nitrierung, …)
- Modifizierungen mit organischen Gruppen (Formulierung, Glykosydierung, Acetylierung, …)
- Bindung an größere Moleküle
- Hinzufügen von Bindungen
uvm.
Quantitative Bestimmung durch Färbetests
- genaueste Methode zur Bestimmung des Proteingehalts: Protein aus wässriger Lösung gefrieren und dann abwiegen
- oft aber Färbereaktionen oder Spektroskopie ausreichend (ACHTUNG! Störfaktoren)
- Farbreaktionen mit bestimmten funktionellen Gruppen in den Seitenketten oder mit dem Peptidrückgrat (weiteres wesentlich genauer)
- immer Mehrfachbestimmungen (mind. 3) und Blindprobe machen
- nur für einen bestimmten Konzentrationsbereich linear (umso mehr Protein, desto deutlicher gefärbt), Probe ggf VOR der Färbereaktion verdünnen
Biuret-Farbereaktion
Reaktion mit Kupfersulfat im alkalischen wässrigen Milieu
- Peptidbindungen komplexieren Cu2+ –> rotviolette Färbung
- Tyrosin reagiert auch mit Cu2+ –> kann die Farbe intensivieren und das Ergebnis verfälschen
- störend wirken Ammonium, Reduktion- und Oxidationsmittel
Lowry-Farbreaktion
Kupfer-Protein-Komplex wie bei Biuret, anschließende Reduktion von Molybdat oder Wolframat durch Tyr, Trp, Cys, His im Peptid –> Cu2+ wird zu Cu+ –> zusätzliche Farbreaktion
- erhöht die Sensitivität ggüber nur Biuret
- störend wirken EDTA, Ammoniumsulfat, Triton X-100
Bicinchorinsäure (BCA)-Farbreaktion
Biuret + BCA
- ebenfalls Cu2+ zu Cu+ reduziert –> BCA bildet mit Cu+ einen Farbkomplex
Bradford-Test
- einziger Farbtest ohne Cu-Ionen
- Coomassie-Brilliantblau G250 –> Absorptionsmaximum verschiebt sich in Anwesenheit von Proteinen im sauren Milieu
- einfachster und empfindlichster Test
- aber auch “subjektivster” –> Reaktion mit funktionellen Gruppen (Arg, z.T. Lys, His, Trp, Tyr, Phe) in den Seitenketten kann das Ergebnis verzerren
Spektroskopische Methoden
- sind im Vergleich zu Farbreaktionen unempfindlicher und benötigen höhere Proteinkonzentrationen
- UV-Absorption von aromatischen AS: ungenau, da nicht jedes Peptid gleich viele aromatische AS enthält (z.B. Trp wird bei 279 nm gemessen, Gehalt in verschiedenen Proteinen kann stark variieren)
- UV-Absorption der Peptidbindung: unabhängig von AS-Zusammensetzung, aber manche AS oder Puffer haben Absorption im gleichen Bereich und können so stören/ verfälschen
- Eigenfluoreszenz von Trp: man muss eine Kalibiergerade aufnehmen können, Anregung bei 280 nm, Emission bei 320-350 nm gemessen, nur bei sehr sauberen Lösungen möglich, Phe hat kauf Fluoreszenz, Trp wird gequentcht
Eigenschaften von Proteinen
- größere Proteine lassen sich schwerer isolieren und analysieren als kleinere
- kleine Proteine: chromatographisch trennen; größere: elektrophoretisch trennen
- selektive Reinigungstechniken: hochselektiv aber schlechte Trennkapazität (z.B. Affinitätschromatographie)
- hydrophobe Proteine (v.a. Membranproteine) können oft nur mit Detergenzien unter Denaturierung getrennt werden (würden ohne Zusätze im wässrigen aggregierten und ausfallen)
- überexprimierte Proteine oder in großen Mengen vorhanden wesentlich leichter zu isolieren
- Säure-Base-Eigenschaften der Proteine oft für die Trennung genutzt, Ladung hängt vom pH ab (niedriger pH = positiv, hoher pH = negativ)
- Reinigung dadurch erschwert, dass Unterscheidung manchmal nur durch biologische Aktivität möglich ist, diese aber oft verloren geht bei der Reinigung (Denaturierung etc.), Denaturierung ist fast immer irreversibel !
- Proteine außerhalb ihres biologischen Milieus oft instabiler
- weitere Probleme: Abbau durch Proteinen (können durch Protease-Inhibitoren gehemmt werden vor der Isolierung) oder es entstehen unlösliche Aggregate
- Reinigung allgemein schnell und bei niedrigen Temperaturen durchführen
Zielsetzung einer Proteinreinigung
- es gibt keine schematische Vorschrift - jede Reinigung ist ein Einzelfall
- Reinigungsschritte hängen von der Zielsetzung ab (Sequenzanalyse? Soll biologische Funktion vorhanden bleiben? etc.)
- grobe Vorgehensweise: Vorreinigung (Matrixkomponenten abtrennen) –> Fraktionierung (chromatographisch) —> Feinreinigung
Vorgehen bei einer Sequenzanalyse:
- geringe Menge an Protein ausreichend
- Sequenzinformation ermöglicht Herstellung von Oligonukleotid-Sonden und Isolation des Gens des Proteins (wird in Gasorganismen dann für weitere Analysen in viel größerer Menge exprimiert –> im Gramm Maßstab)
- bei der rekombinanten Synthese in Wirtsystemen können Tags eingeführt werden (z.B. z.B, His-Tag –> 6x Histidin –> komplexiert mit Nickel, wird zur Isolierung verwendet); Tags erlauben Reinigungskontrolle, die nicht für jedes Protein neu optimiert werden muss
- Feinreinigung dann mit Elektrophorese oder Chromatographie (abhängig von der zur Verfügung stehenden Menge)
Proteom-Analyse: Die Verhältnisse der Proteine dürfen nicht verändert werden, aber der Erhalt der biologischen Funktion ist nicht so wichtig
Allgemeine Vorgehensweise bei der Reinigung/Isolierung
- extrazelluläre Proteine: bereits gelöst in wässrigem Milieu, Abtrennen der unlöslichen Teile und Aufkonzentrieren ausreichend
- intrazelluläre Proteine: Zellaufschluss
- Membranproteine: Isolierung der entsprechenden Membranfraktion –> leichter sind periphere Proteine (milde Bedingungen ausreichend: hoher pH, EDTA dazu), am schwierigsten integrale Proteine zu isolieren (sehr Hydrophobie, agggregieren gerne in Wasser, viel Detergenzien benötigt
- Strukturproteine: oft über PTMs quervernetzt –> zuerst lösliche Proteine abtrennen, dann Quervernetzung auflösen, dann Rest isolieren –> Protein denaturiert meistens
- Gesamt-Proteine: Fällung mit Salzen oder organischen LM (Hofmeister-Serie)
- Zentrifugation: zur Abtrennung von unlöslichen Bestandteilen, Isolierung von Zelorganellen etc.
- Ultrazentrifugation im Vakuum um Widerstand zu reduzieren
- Differentielle Zentrifugation: Sedimentationsgeschwindigkeit ausreichend unterschiedlich (z.B. Zellkerne - Mitochondrien), kann auch zum Aufkonzentrieren verwendet werden
- Zonenzentrifugation: Sedimentationsgeschwindigkeit nicht ausreichend unterschiedlich –> Dichte- oder Viskositätsgradient im Medium
- Abtrennung von Salzen (z.B. wenn Pufferzusammensetzung oder Ionenstärke für den nächsten Reinigungsschritt ungeeignet): Dialyse, Ultrafiltration, Gelchromatographie
- Ultrafiltration: verwendet Membran, die für kleine Salzmoleküle durchlässig ist (Dialyse auch), Einweg-Gefäße mit Membran in einer Zentrifuge, auch geeignet zum Aufkonzentrieren und Entfernen von Detergenzien
- Dialyse: regenerierte Zellulosemembran (vor Gebrauch gut spülen) –> Probe in Dialyseschlauch füllen, Schlauch dann in Gefäß mit Puffer oder Wasser geben, Puffer nach 4-6h austauschen (GGW hat sich dann eingestellt und es diffundiert kein Salz mehr aus dem Schlauch)
- spezielle Methoden zum Abtrennen von Detergenzien: als letzter Schritt, weil dort hydrophobe Proteine nicht mehr in Lösung bleiben
Dialyse - Praktikumsbeispiel
- im Praktikum beispielhaft um die Plasmaproteinbindung eines Arzneistoffs zu analysieren (prozentuale Plasmaeiweißbindung eines unbekannten Sulfonamids
- freies Sulfonamid diffundiert aus dem Dialyseschlauch in die Pufferlösung
- Sulfonamid-Eiweiß-Komplex löst sich, um im Schlauch wieder GGW von gelöstem und gebundenem Sulfonamid herzustellen, gelöstes wird aber kontinuierlich weggenommen
- Dialyse wird nach 24h gestoppt und die Konzentration des Sulfonamids photometrisch bestimmt –> Diazokopplung mit Bariton-Marshall-Reagenz (ergibt farbige Azoverbindung, deren Extintion bei 546 nm gemessen werden kann (zuerst Kalibriergerade erstellen !!)
Chromatographische Trennmethoden für Proteine:
Moleküleigenschaft –> Trennmethode
- Größe, Form –> Ausschluss
- Ladung –> Ionenaustausch
- Biospezifität –> Affinität
- Komplexierung –> Metallchelate
- Hydrophobizität –> Hydrophobie WW (reversed phase: hydrophobe stationäre Phase)
Gelchromatographie
- Gelfiltrationschromatographie = wässrig (nur diese für Proteine relevant)
- Gelpermeationschromatographie = organische LM
- Trennung aufgrund unterschiedlicher Permeation in einem porösen Trägermedium mit definierter Porengröße
- kleine Moleküle dringen in die Poren, bleiben länger drin als größere Moleküle, werden später eluiert und detektiert
- zur Fraktionierung von Proteinen oder Abtrennung niedermolekularer Bestandteile (z.B. Salze)
- Probe immer verdünnt auftragen
- kaum/keinen Einfluss auf das Trennverhalten
Gelchromatographie - Praktikumsbeispiel
Trennung von Dextranblau (2 Mio g/mol) und Vitamin B12 (Cobalamin, 1355 g/mol)
- Detranblau –> blau wegen Cibachonblau an Dextran
- Cobalamin –> rot wegen Anregung der d-Elektronen im Cobalt
- Trenngel: Sephadex G 15 (Moleküle mit bis zu 1500 g/mol können in die Poren eindringen)
- mobile Phase: Wasser
- Messung der Extraktion von Vitamin B12 bei 361 nm
Ionenaustauschchromatographie
Anionenaustauscher: - quarternäre Hydroxypropyldiethylaminoethylgruppen (QAE) - quarternäre Trimethylaminoethylgruppen (Q) - Diethylaminoethylgruppen (DEAE) Kationenaustauscher: - Sulfonmethylgruppen (S) - Sulfopropylgruppen (SP) - Carboxylmethylgruppen (CM)
- Protein je nach pH und AS mit Seitenketten und PRMs sauer oder basisch, Tertiärstruktur gibt die Ladungsverteilung an der Oberfläche vor
- pH für die IAC möglichst weit weg vom IEP wählen, damit Protein stark geladen ist und gut mir Ionenaustauscher wechselwirkt
- Puffer so wählen, dass sowohl Protein als auch stationäre Phase ionisch vorliegen (entgegengesetzt geladen)
- Bsp: DEAE bindet negative Proteine gut, positive und neutrale laufen durch
- Eluation mit Puffer mit NaCL mit steigender Konzentration –> Cl (oder Na) konkurrieren mit Protein um Bindung am Austauscher –> irgendwann alle Proteine eluiert
- alternativ über pH-Gradienten beim Eluieren: Protein wird weniger stark ionisch, bindet schwächer/ nicht mehr an Austauscher und wird ausgespült
- sehr leistungsstarkes Trennverfahren, Protein wird dabei aufkonzentriert
Affinitätschromatographie
- nutzt das spezielle, reversible Bindungsvermögen von komplementären Molekülen (z.B. Antigen/Antikörper, Glykoproteine/Lektine, Enzyme/Coenzyme)
- synthetisch zugänglicher Partner wird an Matrix immobilisiert (= stationäre Phase)
- gewünschter Partner wird aus komplexem Gemisch gebunden –> gut waschen –> Partner wird wieder eluiert (z.B. durch pH-Änderung –> Konformationsänderung –> WW kommen nicht mehr zustande)
- Bsp: Glykoproteine von Lektinsäule eluieren auch möglich mit Zucker als kompetitivem Liganden
- gruppenspezifische Liganden (z.B. Lektin/Glykoproteine) oder monospezifische (Antikörper/Antigen)
- stationäre Phase fertig zu kaufen oder selber aus aktiviertem Gel und aktiviertem Liganden zusammenstellen
Affinitätschromatographie - Metallchelate
- Nickel-Chelat-Chromatographie
- viel verwendet in der rekombinanten DNA-Technologie
- His6-Tag bildet Komplex mit Ni2+ (gebunden an Nitriloessigsäure in Sepharose) –> ein Ni2+ wechselwirkt mit 2 His
- Eluation mit Imidazol-Gradienten oder über pH-Änderung (pH-Änderung kann aber zur Denaturierung der Proteine führen, wenn diese sehr empfindlich sind)
