VL3 Proteinreinigung Flashcards
FusionsPROTEINE
zur Aufreinigung
Abspaltung der Fusionsproteine
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-sehr beliebt TEV-Protease aus Pflanzen (sehr Spezifische Erkennungssequenz ) Ser oder Gly bleibt noch an Zielprotein dran. Sehr spezifisch und potent.
Reinigung über FusionsPEPTIDE Fusion-Tag am Protein in der Regel am C-Terminus (N-geht auch ) ▪Strep-Tag (WSHPQFEK) ▪FLAG-Tag ▪myc-Tag (EQKLISEEDL) ▪HA-Tag ▪His-Tag. (HHHHHHH)
Die Säule ist aufgebaut mit:
- Streptavidin
- anti-FLAG-Antikörper
- anti-myc-Antikörper
- anti-HA-Antikörper
- spezieller Chelator
gebundenes Protein, von der Säule lösen
Protein-Komplex abbauen, mit
Säure Puffer (pH=2), dann schnell (Tris-Puffer ) Protein denaturiert.
His-Tag: Säule ist mit speziellen Chelat
Strep-Tag:
His-Tag Metallchelataffinitätschromatographie (IMAC)
Nickel-Ionen auf Säule befestigt mit Spacer, (Giftgrün)
Ni (2+) bidet N in His seht gut.
Ni-NTA (Nitriloessigsäure) 2 Bindestellen übrig
Ni-IDA (Iminodiessigsäure) 3 Bindestellen übrig
2 His können mit Nickel-Ion binden und werden so auf die Säule befestigt.
Protein von IMAC-Säule lösen
- Imidazole dazugeben, höher Bindungsaffinität als His an das Nickel
- oder pH senken, dann aber Probleme mit Denaturation
Wiederverwenden der Nickelsäule
Matrix mit EDTA-Reinigen, alles Nickel wird von der Säule mit dem Protein gereinigt.
Vorteile von Fusions-Tag
Allgemein:
▪ Löslichkeitsverbesserung
▪Schutz vor Proteasen (am N- und C-Terminus)
▪können Oligomere erzwingen / verhindern
▪ kein direkter Kontakt des Proteins zur festen Phase bei der Reinigung==> verhindert Fehlfaltung
Am N-Terminus
▪verringern Sekundärstruktur am 5‘-Ende der RNA
▪ => bessere Bindung des Ribosoms ==> höhere Ausbeute
Am C-Terminus
▪stellen sicher, dass nur vollständig exprimierte Proteine gereinigt werden
Strevtavidin
bindet hochspezifisch und fast (kovalent) Biotin
durch WW mit den Aminosäuren aus der Umgebung, fast nur H-Brüclen
Streptavidin ist ein Homotetramer
+ kann mehrere biotinylierte Moleküle binden
- es bindet zu fest (Kdiss= 10^-15M)
Entwicklung des Strep-Tag
nur hinten anbringen, Sequenz geht in die Bindetasche des Streptavidin, bindet fest, aber schonend wieder von der Säule lösbar.
Strep-Tag II: auch vorne anwendbar
Das StrepTag-Reinigungssystem
Reiningung kompetitiv mit Biotin, leicht ansäuern
dann ist das Steptavidin wiederverwendbar.
Single Chain Fv
Antikörper wird verändert, in dem man die DNA-Frequenz in E.coli ändert
Wie kommt man zu randomisierte Sequenzen?
gelenkte Evolution, Selektion
Synthetische DNA
PCR, zur Vervielfältigung
Primerdesign
DNA synthetisieren
Synthetische DNA
DNA-Synthese von 5’ zu 3’
Gegenstrang dient als Matrize (Okazaki-Fragmente)
PCR ist leichter, wenn man Doppelstrang hat
-schmelzen
- Primer Anlagerung
-Polymerase mit Taq-Polymerase aus Hypothermophilen
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DNA Absorption (Wellenlänge)
260 nm
Extinktion nimmt zu, wenn DNA schmilzt
