VL2 Proteinreinigung

Question 1

Chromatographic Separation Methods for Proteins

Answer 1

Größe/Form. Ausschluss
Ladung Ionenaustausch
Hydophobe WW Hydrophobe Interaktion/reversed Phase
Biospezifität Affinität
Komplexierung Metallchelate
freie Thiolgruppen kovalente Vernetzung

Question 2

Analyt

Answer 2

Substanz, die aufgereiningt werden soll

Question 3

feste Phase

Answer 3

Silikagel fest in der Säule

Question 4

Chromatogram

Answer 4

Graph der Messung

Question 5

Eluat

Answer 5

Mobile Phase, die unten aus der Säule kommt

Question 6

Eluent

Answer 6

Mobiele Phase, in der der Analyt gelöst ist

Question 7

FPLC

Answer 7

Fast Protein Liquid Chromatographie
Aufbau zum HPLC gleich, allerdings ist der Druck viel geringer, und die Trennstufenhöhe einer FPLC - Säule ist viel größer.

Question 8

IEX

Answer 8

Ion Exchange Chromatographie

Question 9

Kationenaustauschchromatographie

Answer 9

positiv geladen Proteine
pH soll < pI - 1 sein

Sulfonat S 2
Sulfoethyl SE 2
Sulfopropyl SP 2-2,5

Question 10

Anionenaustauscher

Answer 10

neg. geladene Proteine
pH soll > pI +1

Diethylaminoethyl DEAE 9,0 bis 9,5
Trimethylhydroxypropyl QA
Quarternäre Aminoethyl QAE

Question 11

Affinitätschromatographie

Answer 11

Proteine mit Fusions-Tag werden auf Säule eluiert, die mit Liganden bestückt ist.

Protein bindet an Säule, Säule wird gespült um alles wegzubekommen, was man nicht haben will.

Dann wird mit X gespült, X ist affiner als Ligand => Protein löst sich von der Säule uns ist in Eluat.

Ist eine konzentrierende Methode

Question 12

Molekularbiologische Proteinkonjugation

Answer 12

Das Zielgen, wird in Expressionssystem integriert. Nach Expression, entsteht Fusionsprotein: MBP-Zielgen

Reinigung auf einer Amylose-Säule
Elution mit Maltose
Spaltung, des Fusions-Tags mit spezifischen Proteasen

Question 13

am Protein

▪Hexahistidin-(His6)-Tag
▪Glutathion-S-Transferase (GST) -Tag
▪Maltose-Bindeprotein (MBP)-Tag
▪Chitin-Bindeprotein (CBP)-Tag

Answer 13

auf der Säule

• Ni-NTA
• Glutathion
• Amylose
• Chitin

Question 14

▪ Fc-Domäne
▪Strep-Tag
▪FLAG-Tag
▪Myc-Tag 
▪Hämagglutinin-(HA)-Tag

Answer 14

Protein-G
Streptavidin 
anti-FLAG-Antikörper 
anti-myc-Antikörper 
anti-HA-Antikörper

Question 15

Affinitätschromatographie mit ß-Lactamase

(Bla)-Tag

Answer 15

Säule: Phenylboronatsepharose
Eluation: ß-Lactamen (Penicillin)

Zwischen Bla-Tag und Zielprotein ist eine
Pro-Pro-Thr-Pro-Sequenz die mit einer Protease abgespalten wird.

Question 16

Proteasen, zur Abspaltung von Fusions-Tags

Answer 16

Kollagenase
Enterokinase
FaktorXa
Thrombin
TEV-Protease