VL 6 Insulin 2 Flashcards
Rekombinante Methode
bei E.coli
A und B kette werden getrennt voneinander produziert. (als Fusionsproteine mit ß-Galactosidase )
Alle Cysteine und Methionine wurden entfernt.
Bromcyanspaltun
spaltet ß-Galactosidase und Ketten an einem Methionin
70 % Ameisensäure (flüchtig
Proteine kann man im Äther ausfällen.
Oxidative Sulfitolyse
Protein ist stark neg, kann in Lösung gehalten werden und durch Ionenaustaschchromatographie hufgereinigt werden.
Richtige Faltung
Faltung ist eine IntramolekulareWW
Triebkraft Hydrophobe WW
Gluthation
ein Tripeptid welches Hilft richtige Disulfidbrückenbildung fördert.
Arginin in der Lösung
hilft bei der Proteinfaltung 0,5 M
Hefe als Expressionsorgansimus
▪Heterologe Expression funktioneller humaner Proteine möglich ▪Proteinfaltung in korrekte Konformation
▪Ähnliche Exportproteine
▪Gut etabliertes System
▪Einfache genetische Manipulation ▪Preisgünstige, einfache Kultivierung ▪Kurzer Lebenszyklus (90 min)
▪31% der Proteine sind ortholog zu menschlichen ▪Vergleichbare Permeabilität der Membran
Expression von Mini Pro-Insulin in S. cerevisiae
C-Peptid ist stark verkürzt im Vergleich zum Humanen (weil in der C-Kette natürliche Schnittstellen sind )
B-Kette hat man das letzte As verändert um C-Peptid raus zuspalten
Insulinvarianten - Lispro-Insulin
Hat B28 und B29 (Lys und Pro ) getauscht.
Sehr schnell wirkendes Insulin, es wird nicht mehr Dimerisiert –> aktives Monomer.
Insulinvarianten - Insulin-Aspartat
B28 Pro ist durch Asp ausgetauscht.
auch keine Dimerisierung noch potenter als Lidpro-Insulin
Insulinvarianten - Insulin Glargin
B31 und B32 Arg Arg eingesetzt, bildet stabiles Hexamer, wirkt sehr lange
Regulation der Insulinfreisetzung
GLP-1 regt die Freisetzung von Insulin in den ß-Zellen an.
GLP wirkt als Aktivator und Hemmer
Gliptine
Die Gliptine haben eine Prolinähnliche Struktur, da DPP-4 vorzugsweise Dipeptide abspaltet, die an zweiter Position des N-Terminus ein Prolin (oder Alanin) enthalten.
Hefe /Ecoli Schaukelvektor
Plasmind enthält 2 Replikationsursprung und Promotoren
für beide Organismen (Hefe und Ecoli)
- wird in Ecoli vermehrt
- kann in Hefe expremiert werden.
Transformation von S. cerevisiae
Aufschluss der Zellwand:
- Behandlung mit Zymolase (auch: Lyticase)
- Alternativ: hypotonischer Schock
- Transformation mit CaCl2 und PEG;
- Alternativ: Lithiumacetat + PEG + DMSO + Lachssperma-DNA(!)
Selektion über Auxotrophie auf Mangelmedium, z.B.
- minus Leu (für LEU2),
- minus His (für HIS3)
- minus Uracil (für URA3 )
Chromosomale Integration in S. cerevisiae
integriert Gen für das Protein in das chromosomale Genom.
Überkreuz-Anlagerung homologer Sequenzen
Nachteile der Expression in S. cerevisiae
▪kein starker, induzierbarer Promotor
▪ ethanolische Gärung bei hohen Zelldichten (problematisch bei
Promotoren, die durch Glucosemangel induziert werden)
▪ relativ niedrige Produktausbeuten (1-5 % d. Gesamtproteins)
▪Heterologe Proteinexpression in Wachstumsphase behindert Wachstum
▪z.T. Hyperglykosylierung von rekombinanten Proteinen
▪ ⇒ verminderte Aktivität, ggf. Immunogenität (1,3-mannosidische Bindung) ▪häufig geringe Sekretion von Zielproteinen in Kulturüberstand
Alternative: Pichia pastoris
▪ methylotroph (kann von MeOH als einziger C-Quelle leben!)
▪ sehr starker, gut induzierbarer Promotor verfügbar
▪ hohe Produktionsraten intrazellulär lokalisierter Proteine
▪ seltenere Hyperglykosylierung
▪ keine 1,3-Verknüpfung von Mannose
▪ effektive Sekretion vieler Proteine
⇒ N-terminales α-Faktor Sekretionssignal
▪ extrem hohe Zelldichten im Fermenter erreichbar
▪ stark reduzierte alkoholische Gärung
(bei hohen Zellzahlen keine tox. c(EtOH))
