VL 5 Insulin Flashcards
Insulin
- Steuersignal, Zellen sollen Zucker aufnehmen
- Fördert Glykogensynthese in der Leber
- fördert AS Aufnahme in Muskel und Proteinsynthese
Insulinsynthese
in ß-Langerhans-Inselzellen
Sensoren auf dieser Zelle , die Glucose in die Zelle transportieren
Ist viel Glucose vorhanden, soll Insulin ausgeschüttet werden, um Glucose aufzunehmen.
ß-Langhans-Inselzellen
im Pankreas
wenn man diesen entfernt, kommt es zu Diabetes
Aufbau Insulin
2 Ketten
A-Kette (kurzer)
B- Kette (länger)
verbunden über 2 Disulfidbrücken (Cystein).
Gibt eine weitere Disulfidbrücke in der A-Kette
Schweine Insulin
An der B-Kette ein weiteres Alanin.
Wirktung ist gleich, aber Immunsystem erkennt dies und baut Antikörper auf.
Insulin wurde umgebaut,von der Höchst AG, Ala wurde durch Threonin ersetzt.
Prä-Pro-Insulin
eine Kette:
Singnalpeptid –> B-Kette–> C-Kette—>A-Kette
wird ins ER synthetisiert, dort wird Signalpeptid abgespalten und als Vehikel zum Golgi-Apparat.
Dort wird es erneut umgebaut, C-Kette wird abgespalten
Singalfrequenz, um Synthese in das rER
C-Peptid, damit es richtig gefaltet wird.
Aufbau Insulin
Hexamer (zusammen gehalten durch Zinkion)
als Hexamer inaktiv
Momomere sind wirkungsaktiv
Umbau Schweineinsulin –> Humanesinsulin
Schweineinsulin + Theoninethylester , 55% DMF
intubieren mit Trypsin
nach 6 Stunden wird es ausgetauscht
warum Prothese?: Trypsin spaltet nach Lysin und Arg !
Das Arg in mitten der B-Kette (schlechter zugänglich )
Warum org. DMF?: bei der Esterspaltung wird Wasser benötigt. Bei Wasserarmut wird andere AS angeboten
Aufreinigung war ne Bitch
Funktion Trypsin
Serin-Protease (Ser im Aktiven Zentrum /OH im Aktivenzentrum)
Katalytische Triade
Wasserarmut bei 55% DMF, AS wird ersetzt
Proteinproduktion in E.coli
E.coli hat Periplasma
kann Signalpetid vor A oder B-Kette machen, um ins Periplasma anzureichen (Osmanischer Schock)
Bedingungen zur Faltung
oxidierende Bedingungen ( In Vehikeln )
Andere Strategie
Protein im Cytoplasma der Zelle zu explizieren (Disulfidbrücken können nicht gefaltet werden )
Protein in großen Mengen produziert (E.coli erkennt, das es ungehalten ist, oder Einschlusskörper )
Lässt e.coli ß-Galactosidase + A-kette synthetisiert ==> kann nicht falten! Es bilden sich sogenannte Einschlusskörßerchen
Diese fallen in der Zelle aus ! Sind vor Abbau durch Proteinen geschützt ! Dafür müssen diese aber schnell hergestellt werden.
Wie kann man ß-Galactosidase und Insulin kombinieren
Enzyme die DNA-Sequenzen —> in Plasmid
Plasmid in Ecoli
Ecoli mit Plasmid isolieren auf tetracyclin-Agar (Zellen ohne Plasmid sterben)
ß-Galacotisdase-Fusionsproteine wird hergestellt
aufreinigung
ß-Galacotisdase abschneiden
Bedingungen für richtige Faltung finden
Effizienz der Produktion steigern
t-RNA´s für bestimmte AS gibt es in Ecoli seltener als im Menschen.
Also werden andere Codons für gleiche AS verwendet
Aufreinigung der Einschlusskörperchen
Hoher Druck auf Zelle
dann Einschlusskörperchen abzentrifugieren
dann unlösliche Fraktion, wird mit SDS aufgetrennt.
Insulinproduktion in E. coli I
2 Stämme, einer produziert A-Kette, der andere die B-Kette
- Vektor mit Fusions-Protein
- Transkription und Translation
- Fusionspeptid wird abgespalten CNBr-Spaltung (
- Oxidative Sulfitolyse (Auf Cysteine kommt SO3- (sehr gut Wasserlöslich)
- unter schonenden Bedingungen Sulfidgruppen wieder lösen und A/B falten lassen.
Mechanismus der Bromcyanspaltung
Spaltet nur hinter Methionin
kein Methionin in A / B-Kette
Wie bekomme ich die Ketten in Lösung
und die anderen ungelöst
Oxidative Sufitolyse
- Spaltung von Disulfidbrücken durch Natriumsulfit unter Ausbildung des S-Sulfit-Derivats
- Umwandlung von Cystein in S- Sulfocystein durch Reaktion mit Natriumtetrathionat und Rückreaktion mit exogenen Thiolen
