VL1 Proteinreinigung Flashcards
Proteinengineering
Konstruktion / Optimierung von Proteinen
Rationales P. Design
vom mathematischen Modell / Computer Modell
zum echten Protein
gerichtete Evolution
natürliche Enzyme, werden bewusst Mutationen ausgesetzt und dann selektiert
Eigenschaften zum Trennen von Proteinen
Größe Molekülgewicht Absorption (nur 3 AS und Disulfidbrücken) pI Epitope spezifische Bindungsorte Enzymatische Aktivität
Methoden zur Trennung nach Größe
SDS-PAGE
MS
EM
X-Ray
Methoden zur Trennung nach Molekül Gewicht
SDS-PAGE
MS
Methoden zur Trennung nach Absorption
UV-VIS Spektroskopie
Methoden zur Trennung nach pI
Isoelektrische Fokussierung
Methoden zur Trennung nach Epitopen
Western Blot
ELISA
Methoden zur Trennung nach spezifischen Bindungsorten
Blot + Liganden Konjugation
Methoden zur Trennung nach Enzymatischer Aktivität
colorimetric
fourimetric Assay
SDS-Page
Sodium-Dodecyl-Sulfate
Gel aus Acrylamid, dieses bildet ein Maschenwerk.
Probe wird durch das Elektrische Feld aufgetrennt.
( P ins neg geladen, und laufen zur Kathode)
Die Trennung beruht nur auf Größe, da SDS die Eigenladung maskiert.
IEF
Gradientengel im Elektrischen Feld
P laufen nicht mehr, wenn sie ungeladen sind.
Trennung aufgrund der Oberflächenladung (pI)
Ansprüche die an ein Gradientengel
- Hohe Pufferkapazität
- gute Löslichkeit in dem pH-Gradient
- gute Leitfähigkeit
- geringes M
es werden Oligoamino- Oligocarboxylic acids verwendet
Basische Ampholyte
sind positiv geladen
Saure Ampholyte
sind negativ geladen
DIGE
Differential Gel Elektrophorese
Probe wird vorher gefärbt
Kontrolle wird anders vorgefärbt
Kontrolle und Probe wird an gleicher Stelle aufgetragen
Spots werden auf Farben A und B untersucht
DIGE
Differential Gel Elektrophorese
Probe wird vorher gefärbt
Kontrolle wird anders vorgefärbt
Kontrolle und Probe wird an gleicher Stelle aufgetragen
Spots werden auf Farben A und B untersucht.
Peptide Mass Fingerprint
zur Intentifizierung von unbekannten Proteinen
- Protein wird mit Protease verdaut ( Schnittstellen müssen bekannt sein)
- Fragmente werden mit dem Massen Spektroskop analysiert
- Massen der Fragmente werden in Online-Datenbanken abgeglichen
=> so kann ein Protein identifiziert werden.
Massen Spektroskopie (Aufbau)
Ionen Erzeuger
Ionen Trenner
Detektor
ESI
Elektronen Spray Ionisation
Kapilare mit Probenlgs. Ist an eine Spannungsquelle angeschlossen. Es werden Tröpfchen mit positiver Ladung in die Kammer geschossen. Diese werden immer kleiner / Ladung konzentriert sich.
Proteine in Gasphase zubringen ist problematisch, diese Methode hilft.
Ist nur für kleine Proteine /-fragmente oder Polypeptide geeignet.
Ergebisse ESI-MS
für ein Protein / Polypeptid entsehen mehrere Peaks.
Da sie entweder ungeladen /einfach, zweifach,… geladen sein kann.
m/z: Software berechnet dann welche Masse das Protein eigentlich hat
Je stärker geladen, desto schneller Läuft es durch.
MALDI-MS
für große Proteine geeignet.
Matrix-Assisted-Laser-Desorptions-Ionisation
Protein Probe wird mit aromatischem Lösungsmittel vermischt. Ein Kristall entsteht, dieser wird mit einem Laser beschossen, der die Proteine sowohl in die Gasphase bringt, als auch ionisiert.
Lösungsmittel soll sowohl aromatisch als auch Säuren haben, damit man sie mit Licht anregen kann, und die Protonen das Protein positiv Laden.
Protein Mass Fingerprinting
das ganze Protein wird im MS analysiert.
Das Protein in Gasphase wird an einem Reflektor reflektiert und in statistische Einzelteile zerlegt.
Software kann dann AS-Sequenz berechnen
Proteasen
Enzyme, die Proteine verdauen können.
Probe kann so vernichtet werden
Kollagen
man kann seine eigene Probe sehr einfach verunreinigen!
Kreatin ist spezifische aufgebaut, an jeder 3. Stelle Gly.
Viel Prolin und Hydroxyprolin enthalten, um Tripple Helix ausbauen zu können.
