virusologie 2 Flashcards
Ciclul infecțios
- Atașarea si intrarea particulei virale
- Traducerea informației genetice
- Replicarea genomului
- Asamblarea particulei virale
- Eliberarea particulei virale
O celulă susceptibilă
-are un receptor funcțional
pentru un anumit virus
- celula poate sau nu poate
suporta replicarea virală
O celulă rezistentă
-nu are receptor
- poate fi sau nu
competentă să susțină replicarea virală
O celulă permisivă
-are capacitatea de a replica
virusul
-poate fi sau nu susceptibilă (prin transfecție)
O celulă susceptibilă ȘI permisivă
este celula care
permite intrarea particulei virale și care permite
replicarea particulei virale
virusuri cultivare
- La început, virusurile nu au putut fi cultivate în culturi celulare
- Majoritatea virusurilor au fost cultivate utilizând animale de laborator
-Ouă de pui embrionate (10-12
zile)
Efectul citopatic (CPE)
si incluziunile
DEFINITIE
-Modificări morfologice induse în celule individuale sau grup de celule de infecția cu virus (rotunjire, contracție, fuziune, agregare, pierderea aderenței, liză)
-Incluziile: sunt modificări mai subtile ale arhitecturii intracelulare a celulelor individuale
Factori de care depinde observarea CPE la virusurile animale
tipul de virus, cantitatea de inoculum
CPE importanta
-este foarte important pentru monitorizarea infectiei virale și deci pentru diagnostic
-Este foarte important de precizat faptul ca nu toate virusurile cauzează un efect citopatic. In consecință, pentru diagnosticul unei infecții virale trebuie să se utilizeze o alta metodă (testul formării de placi etc).
Plaque Assay
-Una dintre cele mai bune analize de infectivitate
* Probabil că este cea mai elegantă, cea mai cantitativă și cea mai utilă analiză biologică pentru virusuri
- este încă utilizată pentru a purifica un stoc viral
PFU/mL
Plaque-forming units pe mililitru
in cazut testului plaque assay, care este scopul stratului de agar semi-solid care se pune peste stratul monocelular de celule infectate
Monostratul cellular acoperit cu un strat
de agar pentru a oprii difuziunea virusului
De câte particle virale avem
nevoie pentru formarea unei placi?
- One-Hit (o linie)
- Two hits: (o curba)
One-Hit (o linie) :
- o particula virala este suficienta pentru a forma o placa
- numărul plăcilor este direct proporțional cu numărul particulelor virale
Two hits: (o curba) :
- mai mult de o particula viral este necesara pentru a forma o placa
- numărul plăcilor este direct proporțional cu pătratul concentrației virusului inoculat (genomul este împachetat in doua particule si deci este nevoie cele doua particule pentru infecție (virusurile plantelor)
Doza infecțioasă 50 sau mediană TCID50/ml
-acea cantitate de agent patogen care va produce modificări patologice in 50% din cultura celulara inoculată.
* Exprimată in TCID50/ml
Endpoint dilution assay
- Celule in fiecare godeu
- Diluții seriate ale virusului de testat
- Incubație
- Vizualizarea efectului citopatic
TCID
tissue culture infectious doses 50%.
infectie
Nu toate particulele virale sunt
infecțioase
Nr. de particule virale (fizice)/Nr.
de particule infecțioase
- O singură particulă poate iniția infecția
- Nu toate virusurile pot iniția infecția :
- Particule deteriorate
- Mutații
- Complexitatea ciclului infecțios
Ciclul de creștere intr-o singura
etapa (”One-step growth cycle”)
- Adsorbție (celulele + virus)
- Diluția culturii (oprim infecția sau sincronizăm cultura)
- Incubare
- Evaluare
Perioada de ECLIPSA
faza în care se pierde infecțiozitatea (când
virionii sunt dezasamblați după ce au penetrat in celule)
Perioada de LATENTA
timpul necesar replicării, asamblării și
eliberării de noi particule de virus înainte de liză
Sincronizarea infectiei: cheia
ciclului “one-step growth
- Infecția sincronă poate fi realizată prin
infectarea culturilor celulare cu un număr suficient de particule virale pentru a fi sigur ca un număr cat mai mare de celule sunt infectate. - Pentru a realiza acest lucru, trebuie să infectăm toate celulele
- Pentru a defini acest număr trebuie să calculam MOI („multiplicity of infections”).
Multiplicitatea infecției (MOI) 1
- Numărul de particule infecțioase adăugate pe celulă
- Cantitatea de virus (PFU) ÷ # de celule
- Nu este numărul de particule infecțioase pe care le primește fiecare celulă
- Daca adăugam 10^7 particule de virus la 10^6 celule atunci MOI este 10:
dar fiecare celulă NU primește 10 particule virale
Multiplicitatea infecției (MOI) 2
- Infecția depinde de coliziunea aleatorie a particulelor virale și celulele
- Când celule susceptibile sunt amestecate cu virusul, unele celule sunt neinfectate, unele primesc una, două, trei sau mai multe particule
- Distribuția particulelor pe celulă este cel mai bine descrisă prin formula distribuției lui Poisson
formula distribuției lui Poisson
P(k) = e-mmk/k!
-P (k): fracțiunea celulei infectate de k particule virale
-m: multiplicitatea infecției (moi)
Celule neinfectate
P (0) = e-m
Celule ce au primit o singură particulă
P (1) = me-m
Celula infectată cu multiplicare
P (> 1) = 1- e-m (m + 1)
-această valoare se obține scăzând din 1 (suma tuturor
probabilităților pentru orice valoare a lui K) probabilitățile P (0) și P (1)
Exemple MOI
-Dacă 106 cells sunt infectate cu un
moi=10:
* 45 celule nu sunt infectate
* 450 cellule primesc 1 particulă
* Restul de celule primesc >1 particule
-Dacă 106 cells sunt infectate cu un moi=1:
* 37% dintre celule nu sunt infectate
* 37% dintre celule primesc 1 particulă
* 26% dintre cellule primesc >1 particule
-Dacă 106 cells sunt infectate cu un
moi=0,001:
* 99,9% dintre celule nu sunt infectate
* 00,099% dintre celule primesc 1
particulă (990)
* 00,0001% dintre cellule primesc >1
particule
Concluzii MOI
- Multiplicitatea infecției este un factor critic în proiectarea unui experiment.
- Un adevărat experiment de multiplicare a unui virus într-un singur pas se poate face numai la MOI ridicat.
- La MOI scăzut: se vor măsura mai multe runde (cicluri) de infecție
- Un experiment realizat la MOI scăzut are utilitate prin faptul că măsoară atât creșterea, cât și răspândirea virusului în cultură,
- Timpul de la infecție pana la instalarea platoului nu reflectă cu precizie timpul necesar unui singur ciclu de infecție.
Măsurarea fizică a particulelor
de virus (pentru virusurile care
nu formează plăci)
- Hemaglutinarea
- Microscopia electronica
- Masurarea enzimelor virale
- Serologie
- Acizii nucleici
Toate aceste tehnici nu ne spun nimic despre infectiozitatea virusului
arbore
filogenetic
măsoară distanța genetică dintre organisme și identifică cele mai apropiate rude
-“Rădăcina” este presupusul strămoș comun al
tuturor organismelor din arbore.
Pentru a construi un arbore
filogenetic
-se compara diferențele dintre secvențele de nucleotide ale mai multor izolate de organisme presupus înrudite.
* Fiecare diviziune din arbore este un “nod”, strămoșul comun al organismelor sau al izolatelor identificate în dreapta
* După o astfel de ramificare, organismele și secvențele lor evoluează independent.
scara
numărul de modificări /lungimea secvenței
Polymerase chain reaction (PCR)
- Cercetare
- Industrie
- Diagnostic
-Produsul PCR nu este același cu
virusul infecțios
