LP 3 Flashcards
Ce este cultura celulară?
Cultura celulară este procesul prin care celulele sunt crescute în condiții controlate, cel mai frecvent în afara mediului natural.
Aplicațiile culturilor celulare
- virusurile și producția de vaccinuri
- fiziologia și biochimia normală a celulelor
- efectele medicamentelor și compușilor toxici asupra celulelor, mutageneză și carcinogeneză
- screeningul și dezvoltarea medicamentelor
- producerea pe scară largă a compușilor biologici.
TIPURI DE CULTURI
CELULARE
- Cultura primară
- Cultură celulară secundară
Cultura primară
Cultura primară conține celule obținute direct din țesutul gazdă și proliferate în condițiile adecvate până când ajung la confluență. Se poate divide până la 5- 20 de diviziuni.
Cultura celulară secundară
Cultură celulară secundară Este subcultura celulelor primare. Se poate divide până la 5-20 de diviziuni.
CARACTERISTICELE
CULTURII CELULARE
- conțin celule normale care își păstrează memoria îmbătrânirii, prin urmare se pot divide de un anumit număr de ori limitat ( sunt cunoscute ca fiind finite)
- sunt utilizate în principal pentru producția și testarea vaccinurilor și mai rar pentru infecția experimentală cu un virus
LINIA CELULARĂ
- Conține celule anormale (tumorale) care se pot replica la nesfârșit (nemuritoare);
- sunt aneuploide (cu un număr anormal de cromozomi);
- Sunt cunoscute ca fiind continue;
- Sunt utilizate pentru infecțiile experimentale virale.
- Cele mai cunoscute linii celulare: HeLa și VERO
Sisteme de creștere a culturilor/
liniilor celulare
- cultură aderentă în monostrat (celulele aderă la substratul recipientului în car cresc)
- cultură în suspensie (celulele plutesc în mediul de cultură)
Exemple de recipiente utilizate
pentru creșterea celulelor
Cultură aderentă în monostrat: flascuri, placi
Cultură în suspensie: STICLE ROTUNDE
Morfologia culturilor celulare
- 3 categorii de bază
- Celule fibroblastice (alungite, aderente)
- Celule epiteliale (poligonale, aderente)
- Celulele limfoblaste (sferice; plutesc în mediu de cultură)
CONDIȚII DE CULTIVARE
- Laboratorul pentru culturi celulare trebuie să fie minim BSL-2;
- Pentru cultivare sunt esețiale:
- Mediu de cultură;
- Ph-ul;
- Cantitatea de CO2 ;
- Temperatura .
MEDIUL
- cea mai importantă componentă pentru cultivarea celulelor;
- furnizează nutrienții necesari, factorii de creștere și hormonii pentru creșterea celulelor;
- Conține:
> aminoacizi, glucoză, săruri, vitamine și alți nutrienți;
> Indicator de pH. - Se adaugă:
> Ser fetal bovin: conține factori de creștere;
> Antibiotice (penicillin+ stereptomicină pentru a evita contaminarea bacteriană)
> Antigungice (Amfotericină pentru a evita contaminarea cu fungi)
Cele trei clase de bază de medii sunt:
- medii bazale ( conțin aminoacizi, vitamine, săruri anorganice și o sursă de carbon, cum ar fi glucoza)
- mediu cu ser fetal bovin redus (sunt formulări ale mediilor bazale îmbogățite cu nutrienți și factori de origine animală, care reduc cantitatea de ser necesară)
- mediu fără ser fetal bovin (înlocuirea serurilor animale cu formulări nutriționale și hormonale adecvate )
pH-ul
- Culturile celulare de mamifere: pH 7,4.
- Liniile celulare : pH 7,0-7,4.
*Galben: contaminare, se schimbă mediul imediat; Portocaliu (pH=7) : se schimbă mediul în 24h; Roșu: totul este în regulă; Fucsia : se verifică cantitatea de CO2
CO2
- Deoarece pH-ul mediului este dependent de echilibrul dioxidului de carbon (CO2), respectiv al bicarbonatului (HCO3–), modificările CO2 pot modifica pH-ul mediului.
- Cantitatea CO2 este în general între de 5-7%.
Temperatura
Pentru o creștere optimă:
- linii celulare umane și de mamifere: 36°C până la 37°C.
- Linii celulare de insecte: 27°C; cresc mai lent la temperaturi mai scăzute și la temperaturi cuprinse între 27°C și 30°C. Peste 30°C, viabilitatea acestor celule scade, iar celulele nu se recuperează nici după ce sunt readuse la 27°C.
- Linii celulare aviare: 38,5°C (de asemenea, la 37°C, dar cu creștere mai lentă).
- Liniile celulare derivate de la animale cu sânge rece (amfibieni, pești) tolerează o gamă largă de temperaturi între 15°C și 26°C.
Contaminarea
- cu bacterii
- cu mycoplasma
- cu fugi
pentru a evita
contaminarea bacteriană
Se dezinfectează absolut tot ceea ce ar putea constitui o sursă de contaminare și se lucrează doar în hotă microbiologică de clasă II.
Pasajul= Subcultura
celulelor aderente
Pasajul celulelor aderente se realizează când celulele au ajuns la 70-80% confluență (se verifică confluența la microscopul ranversat);
- se aspiră mediul de cultură;
- se spală flasc-ul cu PBS (soluție tampon fosfat salin) pentru a îndepărta serul fetal bovin (SFB) ;
- se adaugă tripsină și se incubează 5 minute la 37°C;
- se adaugă mediul de cultură nou;
- dacă se schimbă recipientul se aspiră din recipientul vechi un anumit volum de mediu cu celule, se mută în unul nou și se completează cu mediu de cultură.
Pasajul celulelor în suspensie
- Nu se agită recipientul cu celule înainte de pasaj;
- Se adaugă mediul de cultură în flascul nou;
- Se aspiră o parte din mediul de cultură din flasc-ul vechi pentru a concentra celulele ;
- După agitare se aspiră o cantitate de mediu cu celule și se transferă în flascul nou.
Numărarea celulelor
- Se realizează un amestec între cultura celulară și albastru tripan (0,1 ml de soluție stoc de albastru tripan la 1 ml de celule);
- Se adaugă din amestecul de mai sus o cantitate în camera hemocitometrică și se numără celulele la microscopul optic
Ghid pentru menținerea culturilor
celulare
Vizualizarea celulelor la microscopul ranversat
CRIOCONSERVAREA
Se realizează când celulele sunt:
- sănătoase,
- au confluență de 80%.
* Crioconservarea la -80ºC
* Crioconservarea în azot lichid ( -196ºC)
linia Vero
Celule epiteliale renale de maimuță verde africană
