Utilité clinique des miARNs et Incursion dans le monde des Start-up Flashcards
Qu’est-ce qu’un miARN?
Que font les miARN et par quel mécanisme d’action?
Petit ARN d’environ 20nt qui régule l’expression des gènes
Les miARN sont impliqués dans la majorité des processus cellulaires et biologiques essentiels (développement musculaire, organe, coeur) et sont dérégulés dans les maladies humaines (ex: suppresseurs de tumeur ou oncogènes)
Un cluster de miARN peut être impliqué dans la formation de cancer, mais dans certain cas aussi suppresseur de tumeur
Mécanisme d’action:
-inhibe la traduction
-induit la dégradation d’un ARNm en se liant dans le 3’ UTR
Chez l’humain, le mécanisme principal est l’inhibition de la traduction donc il y a seulement les niveaux de la protéine cible qui varie
Plus de 2000 miARN ont été identifiés chez l’humain (conservés à travers toutes les espèces)
Quelles sont les grandes lignes de la découvertes des miARN chez C. Elegans et chez l’humain?
-premier miARN découvert dans labo Dr Ambros et Ruban
-gène Lin-4 était essentiel pour le développement de la larve mais ne codait pas pour une protéine
-deux ARN (22 et 61nt) étaient produits
-Lin-4 avait un site de liaison dans le 3’UTR
-Découverte du 2e miARN en 2000 : Let-7 conservé chez l’humain
Les miARN sont très populaires dans les publications depuis le début des années 2000. Environ combien portent sur des applications thérapeutiques ou diagnostiques?
50%
Décrit les étapes de la biogénèse des miARN.
1.Transcription du précurseur primaire (pri-miARN) : transcription d’un gène codant pour un précurseur appelé pri-miARN. Celui-ci forme une structure en tige-boucle qui contient les futurs miARN ainsi que des séquences non-codantes
2.Clivage du pri-miARN en pré-miARN : se fait la le noyau par la protéine Drosha. Il y a clivage pour la formation d’une structure plus courte et toujours en tige-boucle
3.Exportation du pré-miARN dans le cytoplasme : le pré-miARN pourra alors être traité par les enzymes cytoplasmiques
4.Clivage du pré-miARN en miARN double brin : se fait par une ribonucléase appelée Dicer qui coupe au niveau de la boucle pour former un duplex de miARN (double brin; un brin guide et un brin passager)
5.Incorporation dans le complexe RISC et dégradation du brin passager : la protéine clé de ce complexe est la protéine Ago2. Dans ce complexe, seul le brin guide est retenu
6.Silencing de l’ARNm cible : le miARN mature associé à la protéine Ago2 est maintenant prêt à exercer sa fonction. Reconnaissance des ARNm cible en se liant de manière complémentaire généralement en 3’UTR des ARNm pour
-inhiber la traduction de l’ARNm cible en bloquant le ribosome
-induire la dégradation de l’ARNm cible si sa complémentarité est parfaite ou quasi-parfaite
Décrit comment le principe “multi-cible” s’appliquent aux miARN.
L’expression de plus du tiers des gènes chez l’humain serait régulée par les miARN. Ceci est possible grâce au principe multi-cible.
-Les miARN reconnaissent leurs cibles principalement à l’aide de leur noyaux (2e au 8e nt dans l’extrémité 5’)
-L’extrémité 3’ peut également avoir des appariements imparfaits (mismatch) donc séquences potentielles assez variées
Ce mode de reconnaissance permet le multi-cible : un miARN peut inhiber simultanément l’expression de dizaines, voir de centaines, d’ARNm différents
-siARN: vise plutôt le shutdown de l’expression d’un gène
-miARN: inhibition plus modérée que siARN et sur plusieurs cibles
Principe multi-cible est considéré comme l’avantage de l’utilisation des miARN car il est possible de cibler des voies parallèles (cibler plusieurs joueurs importants)
Donne un exemple du rôle des miARN dans la régulation (indice: E2F).
Exemple de miR-20a qui inhibe la traduction des E2Fs
E2F = facteur de transcription qui active la transcription de ses inhibiteurs
miR-20 = mécanisme protecteur
Les miARN peuvent avoir des rôles contraires. Donne un exemple (indice: miR-20). Explique ce qui peut influencer la réponse finale.
-Surexpression de miR-20 dans cellules de cancer augmente la prolifération et la survie
-Surexpression de miR-20 dans fibroblastes diminue la prolifération et induit la sénescence.
L’importance de la co-expression des cibles varie selon le contexte cellulaire et pathologique.
C’est l’addition de la régulation de l’ensemble des cibles qui définit le phénotype final.
Comment les miARN sont impliqués dans les cancers?
Certains miARN sont des oncogènes et d’autres sont des suppresseurs de tumeurs.
L’effets peut dépendre de la présence des cibles
50% des miARN sont localisés dans les régions amplifiées ou délétées dans les différents types de cancer
Le profil d’expression des miARN permet d’identifier l’origine d’une tumeur (panel de miARN permettrait d’identifier un sous-type de cancer)
Est-ce que les miARN peuvent être détectés dans les liquides biologiques?
Les miARN peuvent être détectés dans les liquides biologiques: identification de centaines de miARN dans plusieurs liquides biologiques
Certains sont spécifiques à des tissus en particulier
Quel est l’avantage principal des miARN?
Les miARN sont très résistants à la dégradation comparativement aux ARNm, et ils sont résistants aux gel/dégel
-Point très intéressant pour l’utilisation des miARN comme biomarqueurs (bonne stabilité)
-Fraction cellulaire des miARN dans le sang (intra-cellulaire) : globules rouges, blanc, plaquettes
-Forme libre des miARN (extra-cellulaire): endosome, exosomes, liés à des protéines (Ago2), dans les lipoprotéines.
–La couche lipidique ou si liés à une protéine (Ago2) = procure une protection des miARN dans la circulation
Comment peut-on comparer les miARN aux hormones?
Les miARN ne sont pas détectables dans le sang uniquement à cause de la nécrose tissulaire et de l’apoptose cellulaire
Les miARN sont sécrétés spécifiquement par une cellule, circulent dans les liquides biologiques, pénètrent dans une cellules cible et y régule l’expression génique
Principe d’hormone = produit à quelque part, uptake par un type cellulaire et agit à distance
Qu’est-ce que la Dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA)?
*Première cause de cécité dans les pays industrialisés
Caractérisée par la perte de la vision centrale
Facteurs génétiques, plus grande incidence avec l’âge, la cigarette et l’obésité
Risque chez un parent du premier degré est 6-12 fois plus élevé
Comment les miARN sont impliqués dans la DMLA?
International AMD Genomics Consortium Study groupe a examiné > 12M variants d’ADN rares et communs chez 16000 patients DMLA et 17 000 contrôle (30 des 34 locus significatifs n’étaient pas dans des régions codantes)
Signature spécifique des miARN dans le vitré des patients atteints de la DMLA (PCR quantitatif)
Implication de miR-146a (augmenté) + miR-106b et miR-152 (diminués) dans pathophysiologie de la DMLA:
-TRAF6 et IRAKI (régulation inflammation)
-Régulation du vieillissement des macrophages
-CFH
-VEGFA
-P21, STAT3
-FGF2 (prolifération cellulaire)
-TGFa
Quelle est la meilleure valeur prédictive pour le diagnostic de la DMLA?
Ratio miR-146a/miR-106b avec données dans le sang et dans le vitré
Comment les miARN contribuent au traitement de la DMLA?
Approche poly pharmacologique pour le traitement des maladies humaines: défi d’identifier des composés chimiques multi-cibles.
La plupart des maladies humaines tel que le cancer impliquent le dérèglement de plusieurs gènes limitant le potentiel des thérapies monogéniques
La fonction intrinsèque des miARN est basé sur le principe de multi-cible
Il existe déjà des miARN pour le traitement de divers troubles (miRNA mimics: miR-103/107 métabolisme, miR-208 défaillance cardiaque, miR-92a néoangiogénèse, miR-33 athérosclérose, miR-21 fibrose, miR-155 inflammation) ou des antagonistes de miARN (antagomirs)
Validation du ciblage de miARN dans des modèles murins:
-Modèle CNV (néovascularisation choroïdienne induite par Laser; 4 brûlures réalisées dans chaque yeux et collecte des rétines et des choroïdes après quelques jours)
–Diminution de l’expression de miR-106b dans la rétine des souris du modèle CNV
-Modèle OIR (rétinopathie induite par l’oxygène; se fait dans une chambre à 75% d’oxygène)
-Administration intraoculaire de miR-106b pour le traitement de DMLA = 50% de réduction de néovascularisation pathologique (2 modèles)
–scratch assay + mir106b = diminution de la migration et de la prolif
–Modèle CNV + administration de mir106 au niveau de l’oeil des souris via lentivirus
Quelles sont les étapes d’identification de nouveaux marqueurs (avec le protocole simple)?
1-extraction ARN (fraction cellulaire et/ou fraction libre)
2-Profilage à grande échelle (quelques échantillons) chip, qPCR, séquençage
3-sélection de miARN (pour étape de validation, plusieurs échantillons)
4-transcriptase réverse: utiliser le miARN comme primer (ajout de queue polyA via RT universelle ou stem loop primer via RT spécifique)
5-amplification PCR et détection du signal
6-détermination de la sensibilité et de la spécificité
Comment identifier les miRSNPs associés au AAMD
Article: Qu’est-ce que le eshha?
Electrochemical steric hindrance hybridization assay (eSHHA): utilisation des effets de stérique pour la détection de protéines directement dans le sang total.
Article: Quel sont la mise en contexte et les objectifs?
Les méthodes classiques de détection des protéines (ELISA, western blot) sont complexes, coûteuses et nécessitent plusieurs étapes
Capteur eSHHA vise à offrir une détection rapide, quantitative et multiplexée de biomarqueurs (POC)
Article: Quel est le principe de la méthode présentée?
exploitation des effets de stérique: quand une macromolécules (protéines) se lie à une séquence d’ADN signal, elle limite son hybridation avec une séquence d’ADN complémentaire attachée à une surface dense.
Réduction du courant électrochimique généré, proportionnel à la taille de la macromolécule détectée
Article: Quels sont les avantages de la méthodes présentées?
-Rapide (détection en moins de 10 minutes)
-Simple (1 seule étape sans étapes de lavage/séparation)
-Sensible (détection en nmol/L)
-Polyvalence (adapté à différents types de macromolécules)
-Multiplexage
Article: Quels sont les conclusions de la validaiton?
Excellente corrélation entre la taille des cibles et la diminution du signal (Ac et streptavidine)
Performances stables dans le sang total, sans dérive du signal (marqueur redox - bleu de méthylène - porté par la séquence du signal
Multiplexage démontré pour deux anticorps dans le sang total
Article: Quelles sont les perspectives?
Capteur pourrait être adapté pour d’autres mécanismes de détection (fluorescence)
Potentiel pour remplacer les technologies coûteuses et complexes en biologie moléculaire
