Qu’est-ce qu’une Leucémie myéloïde chronique?
Néoplasie myéloproliférative caractérisée par une prolifération accrue d’éléments myéloïdes. Plus particulièrement les granulocytes matures et immatures.
La progression est plus lente que la leucémie myéloïde aigue.
- Est un désordre clonal des cellules souches pluripotentes.
Est-ce que la Leucémie myéloïde chronique est rare?
Représente 15% des leucémies.
- La Leucémie myéloïde chronique est une Maladie « rare »:
incidence 1-2 / 100 000 habitants par année
QU’est-ce que des granulocytes qu’on retrouve dans les leucémies?
Les granulocytes sont un type de globule blanc, dans les plus communs et inclus les neutrophiles, les éosinophiles et les basophiles.
- Ils contiennent des granules contenant des enzymes et des protéines qui sont relâchés aux sites d’infection ou d’inflammation.
La LCM est biphasique ou triphasique ? Nomme moi les différentes phases
La LMC est considérée comme biphasique voir triphasique avec:
* une phase chronique qui représente 85% des patients au diagnostic.
* Une phase accélérée: la différentiation des neutrophiles devient dysfonctionnelle et le compte des leucocytes est plus difficile à contrôler.
* Une phase blastique: similaire à une leucémie aiguë dans laquelle les blastes prolifèrent de façon incontrôlée.
Manifestations cliniques de la LMC?
Dépend du stade de la maladie:
* 20-50% sont asymptomatiques. Maladie suspectée en raison d’une FSC.
* Symptômes systémiques:
* Fatigue (34%)
* Malaise (3%)
* Perte de poids (20%)
* Transpiration excessive (15%)
* Saignement en raison de dysfonction plaquettaire.
* Inconfort abdominal (Splénomégalie)
La LMC est caractérisée par la fusion de quels gènes?
La LMC est caractérisée par la fusion de 2 gènes:
* BCR sur le chromosome 22
* ABL1 sur le chromosome 9
* Cette fusion produit BCR::ABL1
* Cette fusion anormale origine d’une translocation entre les chromosomes 9 et 22 t(9;22)(q34;q11) qui mène à la production d’un chromosome 22 anormal appelé le chromosome de Philadelphie.
* Le chromosome Ph est donc formé de la fusion de l’exon 5’ du gène BCR à l’exon 3’ du gène ABL.
Parle moi du point de cassure de la LMC?
Dépendamment de la localisation du point de cassure dans BCR, il y a fusion des premiers 13 ou 14 exons de BCR au
2e exons de ABL1
- p210: créé par la fusion de ABL1 à a2 avec un point de cassure au niveau de la région de e13 ou e14 de BCR:
transcrit e13a2 ou e14a2. Majorité des LMC. - p190 Fusion de ABL1 à a2 avec un point de fusion dans BCR à e1 produisant le transcrit e1a2.
- P230: Fusion de ABL1 à a2 avec un point de cassure dans BCR à e19 produisant le transcrit e19a2
Parle moi du réarrangement BCR-ABL1. Elle code quoi? et parle moi de son activité
Ce réarrangement code pour une protéine de fusion de 210 kDa qui a une activité tyrosine kinase constitutive.
- Cette protéine de fusion inclue un domaine enzymatique provenant de ABL1 et contrairement à la protéine normale qui a une activité kinase bien régulée, l’activité est élevée en raison de la fusion avec une partie de BCR.
- Il en résulte en une production incontrôlée de granulocytes matures et immatures principalement des neutrophiles, mais aussi des basophiles et éosinophiles.
- Cette activité tyrosine kinase constitutive produit
- Une augmentation de la prolifération
- Une diminution de l’apoptose
- Instabilité génomique favorisant la progression
Pourquoi l’activité tyrosine kinase est constitutive?
- Auto-inhibition de ABL1 wt par fermeture de la protéine
- Empêche l’activité de l’ATP
- BCR enlève la portion N-terminal Myristoylé
- La porte reste ouverte…
- ABL régule normalement plusieurs processus cellulaires: prolifération ou différentiation, apoptose ou survie, migration.
Comment détecter le gène de fusion autre que PCR? Parle moi un peu de cette technique. Avantages et inconvénients?
FISH
Technique d’hybridation fluorescente
* Sur échantillon de moelle ou sur échantillon de sang
* Utilise de large sonde d’ADN couplés à des fluorophores.
* Permet d’observer la translocation et la présence du gène de fusion par la colocalisation des sondes.
* Ne permet pas de façon générale de discriminer les points de rupture.
Avantages :
Rapide
Désavantages :
* Sensibilité 2-3% (nb de cellules cancéreuses)
* Utilité questionnable si bon tempsréponse en Dx Mol.
Comment détecter gène de fusion par PCR?
Utilisation de l’ARNm comme matériel de départ.
Parle moi de la RT-PCR en rapport avec BCR-ABL1? avantages et pourquoi elle est utilisées pour ça
- Technique très sensible
- Utilise des amorces spécifiques pour amplifier le transcrit d’ARN messager provenant du fragment d’ADN BCR-ABL1.
- Dépendamment des amorces utilisées on peut détecter les différentes translocations
- L’utilisation d’une pré-amplification dites nested suivie d’amplification plus spécifiquerend cette méthode très sensible.
- La méthode est peu couteuse, sensible, rapideet pas trop demandant en temps techniques:il s’agit de la méthode de référence.
- La technique est utilisée pour mesurer la réponse au traitement et détecter la maladie résiduelle mesurable.
ARN - Transcriptase inverse - cDNA - PCR - qualitatif ou quantitatif
Qu’est-ce que l’amplification dite nested?
PCR ciblé initiale pour BCR-ABL, ensuite utilisation d’autres amorces pour cibler nos mutations et translocations
Nomme moi des désavantages d’utiliser l’ARN. Qu’est-ce qu’on pourrait faire?
Dégradation dans le tube (EDTA, Héparine)
* Impact majeur en pré-analytique.
* Les délais ont un impact sur les résultats:
* Temps entre prélèvement et arrivé au laboratoire
* Temps entre l’arrivée au laboratoire et la stabilisation de l’ARN.
* Impact en post-analytique:
* Condition de conservation (-80 ou N2) et durée de conservation.
* RNAse dans le laboratoire: précaution spéciale pour la manipulation
Utilisation possible :
* Utilisation possible du tube PaxGene pour stabiliser l’ARN.
Comment compenser la dégradation potentielle?
On pourrait utiliser le ratio BRC-ABL1/gêne de contrôle
gêne de contrôle = G6PDH
Qu’est-ce que permet le multiplex BCR-ABL1 ?
dépistage et identification du point de cassure
Si négatif: pas de LMC
Qu’est-ce que permet le PCR en temps réel? Parle moi des 2 phases.
Parle moi d’un autre type de PCR en temps réel?
PCR en temps réel via fluorescence spécifique: Technologie TaqMan
- Fonctionne grâce à l’activité 5’ exonucléase de la Taq polymérase
- Amorces spécifiques: Amplicon produit d’environ 100nt
- Sondes
*Fluorochrome en 5’ : FAM, HEX
*Quencher» en 3’ inhibant la fluorescence
Chose importante que la PCR en temps réel à besoin?
La quantification nécessite une courbe standard
Moins il y a de copies de gène ciblé, plus il faudra de cycle avant de l’amplifier
Calcul de la pente via l’utilisation d’une courbe standard (concentrations connues)
Parle moi de la standardisation des résultats de qPCR
% International standardisation
Les laboratoires ne sont pas comparables même avec les mêmes protocoles.
* Un sujet avec une réduction exacte de 3 log pourrait avoir un résultat de -3.2 log ou de -2.9 log dans 2 très bons laboratoires.
*Qui a raison importe peu..
*Celui qui a le bon résultat est celui qui est aligné sur les résultats de l’étude IRIS dont on déduit tous nos guides thérapeutiques.
Il faut que les laboratoires «ajustent» leurs résultats pour être superposable à ceux des laboratoires IRIS.
*Facteur de conversion suite à un échange de spécimens
*Réactifs alignés sur labos IRIS
*Trousse commerciale…
Importance de la diminution de 3log
Diminution de log comparativement au ISI initial indique une réponse cytogénétique complète est obtenue et est considérée comme une étape thérapeutique importante.
Explique moi le principe des logs
SI = médiane des résultats de patients (= 100%)
si on diminue de 1000 fois = 3 log, on est donc en rémission moléculaire
on peut aussi diminuer plus bas
Les oncologue vont donc cibler une diminution de log ou sinon en % si on va en transcrit
95% de survive si on atteint le diminution de 3log atteint
Parle moi de la phase chronique et avancée de la LMC?
Phase chronique:
*présentation clinique la plus commune
*Leucocytose avec une moelle hypercellulaire et prolifération granulocytaire, quelques blastes: <5%
*Stade indolent traité par thérapie orale
Phase avancée ou blastique:
*% augmenté de blastes au niveau de la moelle osseuse.
*Augmentation de la splénomégalie
*Symptômes importants
*Cytopénie
*Instabilité génétique
Qu’est-ce qu’on fait pour faire une évaluation prétraitement du LMC
*Évaluation clinique: cardiovasculaire, pulmonaire, rein
*Hématologie: FSC avec frottis
*Biochimie: électrolytes , glucose, enzymes hépatiques, fonction rénale.
*Cytogénétique: sur moelle ou sang: confirmation du chromosome de Ph et anormalités additionnelles
*PCR:
*Qualitatif pour confirmer la détection du réarrangement BCR::ABL1
*Quantitatif pour déterminer le baseline pour le traitement.
*Électrocardiogramme: arythmie
*Radiographie du Thorax pour effusion pleural
-
Transmission des caractères héréditaires et enjeux éthiques75
-
Base moléculaire des maladies génétiques et aspects opérationnels d’un laboratoire de diagnostic moléculaire43
-
Aspects analytiques en diagnostic moléculaire et pertinence d’utilisation64
-
Utilité clinique des miARNs et Incursion dans le monde des Start-up23
-
Maladies infectieuses57
-
Oncogénétique et ddPCR55
