Oncogénétique et ddPCR Flashcards
Qu’est-ce qu’une Leucémie myéloïde chronique?
Néoplasie myéloproliférative caractérisée par une prolifération accrue d’éléments myéloïdes. Plus particulièrement les granulocytes matures et immatures.
La progression est plus lente que la leucémie myéloïde aigue.
- Est un désordre clonal des cellules souches pluripotentes.
Est-ce que la Leucémie myéloïde chronique est rare?
Représente 15% des leucémies.
- La Leucémie myéloïde chronique est une Maladie « rare »:
incidence 1-2 / 100 000 habitants par année
QU’est-ce que des granulocytes qu’on retrouve dans les leucémies?
Les granulocytes sont un type de globule blanc, dans les plus communs et inclus les neutrophiles, les éosinophiles et les basophiles.
- Ils contiennent des granules contenant des enzymes et des protéines qui sont relâchés aux sites d’infection ou d’inflammation.
La LCM est biphasique ou triphasique ? Nomme moi les différentes phases
La LMC est considérée comme biphasique voir triphasique avec:
* une phase chronique qui représente 85% des patients au diagnostic.
* Une phase accélérée: la différentiation des neutrophiles devient dysfonctionnelle et le compte des leucocytes est plus difficile à contrôler.
* Une phase blastique: similaire à une leucémie aiguë dans laquelle les blastes prolifèrent de façon incontrôlée.
Manifestations cliniques de la LMC?
Dépend du stade de la maladie:
* 20-50% sont asymptomatiques. Maladie suspectée en raison d’une FSC.
* Symptômes systémiques:
* Fatigue (34%)
* Malaise (3%)
* Perte de poids (20%)
* Transpiration excessive (15%)
* Saignement en raison de dysfonction plaquettaire.
* Inconfort abdominal (Splénomégalie)
La LMC est caractérisée par la fusion de quels gènes?
La LMC est caractérisée par la fusion de 2 gènes:
* BCR sur le chromosome 22
* ABL1 sur le chromosome 9
* Cette fusion produit BCR::ABL1
* Cette fusion anormale origine d’une translocation entre les chromosomes 9 et 22 t(9;22)(q34;q11) qui mène à la production d’un chromosome 22 anormal appelé le chromosome de Philadelphie.
* Le chromosome Ph est donc formé de la fusion de l’exon 5’ du gène BCR à l’exon 3’ du gène ABL.
Parle moi du point de cassure de la LMC?
Dépendamment de la localisation du point de cassure dans BCR, il y a fusion des premiers 13 ou 14 exons de BCR au
2e exons de ABL1
- p210: créé par la fusion de ABL1 à a2 avec un point de cassure au niveau de la région de e13 ou e14 de BCR:
transcrit e13a2 ou e14a2. Majorité des LMC. - p190 Fusion de ABL1 à a2 avec un point de fusion dans BCR à e1 produisant le transcrit e1a2.
- P230: Fusion de ABL1 à a2 avec un point de cassure dans BCR à e19 produisant le transcrit e19a2
Parle moi du réarrangement BCR-ABL1. Elle code quoi? et parle moi de son activité
Ce réarrangement code pour une protéine de fusion de 210 kDa qui a une activité tyrosine kinase constitutive.
- Cette protéine de fusion inclue un domaine enzymatique provenant de ABL1 et contrairement à la protéine normale qui a une activité kinase bien régulée, l’activité est élevée en raison de la fusion avec une partie de BCR.
- Il en résulte en une production incontrôlée de granulocytes matures et immatures principalement des neutrophiles, mais aussi des basophiles et éosinophiles.
- Cette activité tyrosine kinase constitutive produit
- Une augmentation de la prolifération
- Une diminution de l’apoptose
- Instabilité génomique favorisant la progression
Pourquoi l’activité tyrosine kinase est constitutive?
- Auto-inhibition de ABL1 wt par fermeture de la protéine
- Empêche l’activité de l’ATP
- BCR enlève la portion N-terminal Myristoylé
- La porte reste ouverte…
- ABL régule normalement plusieurs processus cellulaires: prolifération ou différentiation, apoptose ou survie, migration.
Comment détecter le gène de fusion autre que PCR? Parle moi un peu de cette technique. Avantages et inconvénients?
FISH
Technique d’hybridation fluorescente
* Sur échantillon de moelle ou sur échantillon de sang
* Utilise de large sonde d’ADN couplés à des fluorophores.
* Permet d’observer la translocation et la présence du gène de fusion par la colocalisation des sondes.
* Ne permet pas de façon générale de discriminer les points de rupture.
Avantages :
Rapide
Désavantages :
* Sensibilité 2-3% (nb de cellules cancéreuses)
* Utilité questionnable si bon tempsréponse en Dx Mol.
Comment détecter gène de fusion par PCR?
Utilisation de l’ARNm comme matériel de départ.
Parle moi de la RT-PCR en rapport avec BCR-ABL1? avantages et pourquoi elle est utilisées pour ça
- Technique très sensible
- Utilise des amorces spécifiques pour amplifier le transcrit d’ARN messager provenant du fragment d’ADN BCR-ABL1.
- Dépendamment des amorces utilisées on peut détecter les différentes translocations
- L’utilisation d’une pré-amplification dites nested suivie d’amplification plus spécifiquerend cette méthode très sensible.
- La méthode est peu couteuse, sensible, rapideet pas trop demandant en temps techniques:il s’agit de la méthode de référence.
- La technique est utilisée pour mesurer la réponse au traitement et détecter la maladie résiduelle mesurable.
ARN - Transcriptase inverse - cDNA - PCR - qualitatif ou quantitatif
Qu’est-ce que l’amplification dite nested?
PCR ciblé initiale pour BCR-ABL, ensuite utilisation d’autres amorces pour cibler nos mutations et translocations
Nomme moi des désavantages d’utiliser l’ARN. Qu’est-ce qu’on pourrait faire?
Dégradation dans le tube (EDTA, Héparine)
* Impact majeur en pré-analytique.
* Les délais ont un impact sur les résultats:
* Temps entre prélèvement et arrivé au laboratoire
* Temps entre l’arrivée au laboratoire et la stabilisation de l’ARN.
* Impact en post-analytique:
* Condition de conservation (-80 ou N2) et durée de conservation.
* RNAse dans le laboratoire: précaution spéciale pour la manipulation
Utilisation possible :
* Utilisation possible du tube PaxGene pour stabiliser l’ARN.
Comment compenser la dégradation potentielle?
On pourrait utiliser le ratio BRC-ABL1/gêne de contrôle
gêne de contrôle = G6PDH
Qu’est-ce que permet le multiplex BCR-ABL1 ?
dépistage et identification du point de cassure
Si négatif: pas de LMC
Qu’est-ce que permet le PCR en temps réel? Parle moi des 2 phases.
Parle moi d’un autre type de PCR en temps réel?
PCR en temps réel via fluorescence spécifique: Technologie TaqMan
- Fonctionne grâce à l’activité 5’ exonucléase de la Taq polymérase
- Amorces spécifiques: Amplicon produit d’environ 100nt
- Sondes
*Fluorochrome en 5’ : FAM, HEX
*Quencher» en 3’ inhibant la fluorescence
Chose importante que la PCR en temps réel à besoin?
La quantification nécessite une courbe standard
Moins il y a de copies de gène ciblé, plus il faudra de cycle avant de l’amplifier
Calcul de la pente via l’utilisation d’une courbe standard (concentrations connues)
Parle moi de la standardisation des résultats de qPCR
% International standardisation
Les laboratoires ne sont pas comparables même avec les mêmes protocoles.
* Un sujet avec une réduction exacte de 3 log pourrait avoir un résultat de -3.2 log ou de -2.9 log dans 2 très bons laboratoires.
*Qui a raison importe peu..
*Celui qui a le bon résultat est celui qui est aligné sur les résultats de l’étude IRIS dont on déduit tous nos guides thérapeutiques.
Il faut que les laboratoires «ajustent» leurs résultats pour être superposable à ceux des laboratoires IRIS.
*Facteur de conversion suite à un échange de spécimens
*Réactifs alignés sur labos IRIS
*Trousse commerciale…
Importance de la diminution de 3log
Diminution de log comparativement au ISI initial indique une réponse cytogénétique complète est obtenue et est considérée comme une étape thérapeutique importante.
Explique moi le principe des logs
SI = médiane des résultats de patients (= 100%)
si on diminue de 1000 fois = 3 log, on est donc en rémission moléculaire
on peut aussi diminuer plus bas
Les oncologue vont donc cibler une diminution de log ou sinon en % si on va en transcrit
95% de survive si on atteint le diminution de 3log atteint
Parle moi de la phase chronique et avancée de la LMC?
Phase chronique:
*présentation clinique la plus commune
*Leucocytose avec une moelle hypercellulaire et prolifération granulocytaire, quelques blastes: <5%
*Stade indolent traité par thérapie orale
Phase avancée ou blastique:
*% augmenté de blastes au niveau de la moelle osseuse.
*Augmentation de la splénomégalie
*Symptômes importants
*Cytopénie
*Instabilité génétique
Qu’est-ce qu’on fait pour faire une évaluation prétraitement du LMC
*Évaluation clinique: cardiovasculaire, pulmonaire, rein
*Hématologie: FSC avec frottis
*Biochimie: électrolytes , glucose, enzymes hépatiques, fonction rénale.
*Cytogénétique: sur moelle ou sang: confirmation du chromosome de Ph et anormalités additionnelles
*PCR:
*Qualitatif pour confirmer la détection du réarrangement BCR::ABL1
*Quantitatif pour déterminer le baseline pour le traitement.
*Électrocardiogramme: arythmie
*Radiographie du Thorax pour effusion pleural
Quel est le but du traitement de la LMC?
*Atteindre une rémission clinique, cytogénétique et moléculaire pour limiter la progression
*Limiter les effets secondaires
*Palliatif
La sélection du médicament contre la LMC dépend de quoi?
La sélection du médicament dépend de la phase de la maladie et des comorbidités.
Quel est le traitement de choix avant du LMC?
greffe de cellules souches: le traitement de choix avant
Récidive faible
*Guérison
Mortalité reliée au traitement (TRM)
*Varie: 5-15%
*GVH et complications à long terme
*25-30% des patients LMC était éligible
Qu’est-ce qui a apporté à chuté l’utilisation des anciens traitements? Pourquoi? Donne des exemples
Inhibiteurs des Tyrosines Kinases - significativement améliorer la survie des patients
ex: Imatinib
Dasatinib
Nilotinib
Bosutinib
Ponatinib
Est-ce que la prévalence de la LMC diminue au Québec?
Non, elle augmente
Incidence ~stable: 50 / année
Prevalence augmente:
*1200 cas en 2014
*Potentiellement 2500 cas 2025
*100 000 000$ en ITK
Les effets secondaires de ITKs sont dus à quoi?
Les effets secondaires sont liés aux inhibitions non-ciblées (off-target) et varie d’un ITK à l’autre
Nomme moi des effets secondaire similaires communs aux différents traitements ITKs
Dépression médullaire
↑ des transaminases
Δ des taux d’électrolytes
Nomme moi des effets secondaires pour l’ensemble des médicaments ITKS
-Imatinib
Odème, rétention hydrique
Myalgie
↑ de l’hypophosphatémie
Effets GI (diarrhée, nausées)
-Nilotinib
↑ des enzymes pancréatiques
Hyperbilirubinémie indirecte
Hyperglycémie
Allongement de l’intervalle QT
Manifestations CV
-Dasatinib
Épanchement pleural
Risque d’hémorragie
Hypertension artérielle
pulmonaire
Hyperplasie folliculaire
-Ponatinib
↑ des enzymes pancréatiques
Hypertension
Dermatotoxicité
Manifestations thrombotiques
-Bosutinib
Diarrhée
Nausées, vomissements
Éruption cutanée
Atteinte hépatique
Qu’est-ce qui peut affecter l’efficacité des ITKs?
existe une multitude de mutations
Nomme moi des mutations qui peuvent affecter l’effet des ITKs
Y253F/H
E255K/V
T315I (à savoir)
F317L
F359V/I
Qu’elle serait la stratégie contre la résistance aux ITK en raison de mutations? Nomme moi le principe ainsi que les avantages et désavantages
Stratégie de detection: le séquençage
Avantage:
* Est très spécifique.
* Permet de détecter plusieurs mutations.
Désavantage:
* A une faible sensibilité.
* 15-25% des cellules doivent-être mutées.
Principe :
1)Amplification des transcrits BCR-ABL1
2) Séquence des exons 4-9
* stratégie avec une faible sensibilité
Détection: 15-25% des cellules doivent être mutées
Mécanisme de résistance au TKI?
Interférence avec la liaison du médicament
Exemple : au niveau T315I, P loop (diagnostic pauvre), M351T
Est-ce qu’on peut cibler des mutations en fonction des traitements?
Oui
Stratégie analytique de la LMC?
Diagnostique par détection du chromosome Philadelphia (ph1) et faire de la PCR qualitative pour identifier le transcript de fusion BCR-ABL1
Pendant le traitement. après avoir obtenu une réponse complète, des tests cytogénétiques sont recommandés pour voir s’il ya des abberations cytologiques (ACA) dans le clone Philadelphia pendant que l’analyse quantitative par PCR de BCR-ABL1 doit être fait de façon régulier les niveaux du transcript
Lors de rémission sans traitement, seulement la PCRq est nécessaire pour regarder les transcripts de BCR-ABL1.
Si réponse insatisfaisante, il est recommandé de chercher des mutations de BCR-ABL1 par séquencage sanger ou NGS
Avantage et désavantage du dPCR
Avantages :
dPCr serait plus sensibile, précis, permet la détection de seulement 1 transcript de BCR-ABL1, permet la quantification d’une cible sans courbe de calibration
1.Grande précision: fractionnement massif de l’échantillon permet de détecter de très petite variation des séquences d’AND cibles
2.Augmente le ration signal/bruit de fond: enrichissement des cibles rares en réduisant la compétition avec les templates avec beaucoup de copies
3.Élimine le biais associé à l’efficacité de la réaction PCR: élimine le principe d’efficacité d’amplification de la réaction PCR
4.Simplifie la quantification: une courbe standard n’est pas nécessaire pour une quantification absolue.
Désavantages :
Pas standardisé
Pas largement disponible
Avantages et désavantages de la rtPCR
Avantages :
standardisé internationalement
Largement disponible
Désavantages :
sensibilité et précision pauvre à des basses cibles
Faible robustesse
Nécessite courbe de calibration
Qu’est-ce que l’immunothérapie?
*L’immunothérapie aide à renforcer ou à rétablir la capacité du système immunitaire de combattre le cancer (Anticorps, cytokines, interleukine, …)
*L’immunothérapie renforce le système immunitaire ou l’aide à trouver le cancer et à l’attaquer. On a recours à l’immunothérapie pour:
–interrompre ou ralentir la croissance du cancer;
–empêcher le cancer de se propager à d’autres parties du corps;
–aider le système immunitaire à être plus efficace pour détruire les cellules cancéreuses;
–administrer des toxines, comme la radiothérapie ou la chimiothérapie, directement aux cellules cancéreuses.
Quel était le but de le relation entre C3i et l’hôpital?
Vision unité diagnostic
Liaison entre le besoin et les outils diagnostiques
Il va permettre d’offre des outils que l’hôpital ne peut pas se permettre (au Canada)
Qu’elle est l’analyse qui est analysé par C3i?
T315I, une mutation de la fusion BCR-ABL1
Workflow du ddpcr?
Étapes techniques du ddPCR ? Expliquez le principe
1) préparation des master mix pour le PCR en zone pré.
2) Distribution des mix dans les plaques de 96 puits pour la génération de gouttelettes
3)Préparation des goutellette
4) Amplification PCR
5)Lectures des gouttelettes
6) Analyse des données
Expliquez le principe de production de goutelettes
Principe :
*Combine le principe d’émulsion avec les gouttelettes d’huile au micro fluidique.
*Générateur de droplet: partitionne l’échantillon en 20 000 gouttelettes
* L’amplification PCR a lieu dans chaque gouttelette utilisant un thermocycleur.
* Avant la génération de gouttelette: la réaction est préparée comme une réaction PCR standard utilisant des sondes Taman couplées au FAM ou HEX
Expliquez le principe d’amplification d’ADN
- Transfert des goutelles dans un thermo cycleur à 96 puits pour l’amplification des séquences à l’aide des amorces spécifiques aux transcrits BCR-ABL et à la mutation T315I.
Set d’amorces combinées pour:
* ABL
* BCR-ABL p210-e14a2
* BCR-ABL p210-e13a2
* P190-e1a2
* T315I
Expliquez le processus de lecture des gouttelettes
- Suite à l’amplification des cibles dans les gouttelettes, la plaque de 96 puits est déposée sur le lecteur qui analyse chaque gouttelette individuellement à l’aide des 2 fluorochromes FAM et HEX.
- Les goutelles positives qui contiennent au moins une copie de la molécule d’ADN cible ont un signal de fluorescence augmenté.
Expliquez l’analyse des données 1D
- Les données peuvent-être visualisé en 1D mettant en relation le nombre de gouttelettes et et l’intensité de la fluorescence.
- Chaque point représente une gouttelette.
- Les goutelles positives se retrouvent au-dessus du seuil établi.
- Les goutelles négatives se retrouvent sous le seuil établi.
Est-ce que le seuil de positivité est plus important pour le ddPCR que le qPCR?
Comparativement au qPCR, l’ajustement du Threshold au niveau du signal de fluorescence n’a pas d’impact majeur de façon générale sur la quantification de la cible
Expliquez l’analyse des données 2D
Dans le cas ou 2 signaux de fluorescence ont été utilisés la représentation peut se faire en 2D avec le canal 1 représentant la
fluorescence FAM et le canal 2 HEX pour chaque gouttelette.
* FAM: bleu et HEX vert
Est-ce possible d’être positif pour T315I, mais négatif pour BCR-ABL?
Oui, la translocation différente peut causer présence de la mutation sans présence de BCR-ABL
Est-ce que la ddPCR est déterminé grâce à l’intensité de la fluorescence?
Non, déterminé en fonction du nombre de goutelettes positives vs négatives
Le nombre de copie positive par uL peut ensuite être établie afin de comparer différents échantillons de façon quantitative.
Combien de goutelettes il faut au minimum? Si on a pas assez, qu’est-ce qu’on peut p-t faire?
12 000 goutelettes
Peut faire du nested PCR : pré-amplification de BCR-ABL
exemple de patients positif pour la mutration T315I
