Base moléculaire des maladies génétiques et aspects opérationnels d’un laboratoire de diagnostic moléculaire Flashcards

Question

Quel est le rôle du laboratoire dans l'analyse moléculaire des gènes et quelles sont les étapes d'analyse?

Answer 1

-Analyse permettant d’identifier les modifications dans l’ADN des gènes associés au développement de maladies. -Étapes: 1) Prélèvement (sang total, tissus, salive) 2) Extraction de l’ADN 3) Séquençage 4) Analyse des séquences d’ADN 5) Classification des variants (selon lignes directrices)

Answer 2

Dans le cadre des travaux du RQDM (réseau québécois de Dx moléculaire), l’ICM a développé, validé et implanté l’offre de service provinciale en cardiogénétique -Service de traitement accéléré des échantillons prioritaires -Service unique d’autopsie moléculaire pour cas mort subite cardiaque inexpliquée Prescription test génétique par MD → extraction ADN sang total → séquençage 97 gènes → analyse de mutation pathogéniques → rapport remis au MD

Answer 3

Selon la fréquence dans la population (fréquence allélique), étude de ségrégation (arbre généalogique), le type de variant (épissage, codant, non-codant et type de mutation), études fonctionnelles et outils de prédiction bio-info: indique le niveau que le variant est suspecté être classé (très fortement pathologique à fortement bénin) -variant bénin → probablement bénin → signification incertaine → probablement pathogénique → pathogénique

Answer 4

-Cardiomyopathies (au niveau du muscle cardiaque) - cardiomyopathie hypertrophique -Arythmies (au niveau du rythme cardiaque et électricité) - Syndrome du QT long -Aortopathies (au niveau de l’aorte, le plus gros vaisseau sanguin du corps) - Syndrome de Marfan -Dyslipidémies familiales (au niveau du métabolisme des lipides) - Hypercholestérolémie familiale et hyperchylomicronémie familiale

Answer 5

Généralité -Épaississement (hypertrophie) du muscle cardiaque (cardiomyocarde, grosseur du muscle faisant rappetisser ventricule droit) -1ère cause de mort subite chez les moins de 40 ans -maladie du sarcomère cardiaque (perte alignement des myofibrilles) -peut se développer à tout âge (adolescence et début âge adulte) -expressivité variable (même au sein d’une même famille) Prévalence: 1 individu sur 500 à 1 sur 200 Autosomique dominant Présentations cliniques: Fatigue, essoufflement à l’effort, Angine, Palpitations/arythmines, étourdissement, syncopes (perte connaissance brutale), oedème jambes, souvent asymptomatique (1er symp = mort subite) Bases moléculaires: maladie sarcomérique, variant pathogéniques dans gènes codant pour sarcomère cardiaque : MYBPC3 (15-20%), MYH7 (10-15%), TNNT2 (1-2%), TNNI3 (1-2%) et TPM1 (0,1-1%). Perte alignement myofibrilles Implications cliniques de la génétique: -confirmation Dx (identification variant cliniquement pertinent chez 30-50%) -dépistage familial (identification membres famille à risque de mort subite) -indication sur le traitement (défibrillateur préventif selon résultat, suivi)

Answer 6

Généralités -Anomalies électriques sur ECG (allongement segment QT et anomalie de l’onde T) -risque arythmie ventriculaire, syncope et arrêt cardiaque -structure et fonctionnement du muscle cardiaque sont normaux -peut se développer à tout âge (mais + enfance et adolescence) -expressivité variable (même au sein d’une même famille) Prévalence: 1 sur 3000 à 1 sur 2000 Autosomique dominant Présentations cliniques: parfois asymptomatique, allongement segment QT (parfois découvert de manière fortuite; >470ms homme et >480ms femme). Chez d’autres, arythmies ventriculaires → symptômes = palpitations, tachyarythmie (torsade de pointe), syncopes, lipothymies (faiblesse sans perte connaissance), mort subite. -Anomalie électrique déclenchée par différents stimuli (activité physique, auditif, émotion intense, post-partum, repos, médicament) -épisode de noyade dans arbre généalogique peuvent être associé à SQTL Bases moléculaires: maladie canaux ioniques (potassique et sodique) -LQT1: gène KCNQ1 (K+; 30-35% des cas; perte de fonction) -LQT2: gène KCNH2 (K+; 25-30% des cas; perte de fonction) -LQT3: gène SCN5A (Na+; 5-10% des cas; gain de fonction, syndrome de Brugada aussi associé à ce gène mais en perte de fonction) Implications cliniques de la génétique: -confirmation du Dx (près de 30% ayant SQTL ont un intervalle QT dans valeur de référence). présence variant causal aide au Dx -Dépistage familial (identification membres famille à risque de mort subite) -Prévention (défibrillateur, arrêt de certaines activités physiques intenses (nage), arrêt de certains types d’emplois (pilote), éviter mdx allongeant segment QT (informer personnel médical et pharmacien)

Answer 7

Généralités -désordre génétique multisystémique qui affecte tissu conjonctif -systèmes atteints: squelettique, oculaire, pulmonair, cardiovasculaire, peau -caractérisé par dysfonctionnement fibrilline-1 (glycoprotéine matrice extracellulaire) distribuée de façon ubiquitaire Prévalence: 1 sur 10 000 à 1 sur 5000 Autosomique dominant Présentations cliniques: luette bifide, subluxation cristallin, très grande taille disproportionnée (anomalie squelette), Pectus excavatum ou carinatum, hyperlaxité ligamentaire, Anévrisme de l’aorte initiale (à son émergence du coeur) et dissection aortique, prolapsus de la valve mitrale, pneumothorax spontanés Bases moléculaires: variants dans le gène FBN1 qui code pour fibrilline 1 (25-35% des patients présentent un variant de novo; variant généralement uniques à chacune des familles atteintes) Implications clinique de la génétique: -abaissement du seuil chirurgical -séquençage du gène FBN1 est l’étalon d’or pour la génétique -identification variant pathogénique/probablement patho = signe Dx

Answer 8

Généralités -étiologie de la mort subite cardiaque varie selon l’âge --90% des cas: maladie coronarienne et infarctus aigu du myocarde --moins de 40 ans: arythmie ou anomalie structurelle du coeur -anomalies cardiaque non-structurelles correspondent aux arythmies héréditaires --Syndrome QT long --Syndrome Brugada (SBr) --Tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique (TVPC) -anomalies cardiaques de structure correspondent aux maladies de la structure de la cellule musculaire cardiaque --Cardiomyopathie hypertrophique (CMH) --cardiomyopathie arythmogène ventricule droit (CAVD) Prévalence: cause majeure de mortalité, 15-20% de tous les décès mondialement, près de 4% non expliqué Autopsie moléculaire (74 gènes) pour mort subite inexpliquée: Analyse génétique post-mortem pour identifier modification ADN gènes associés à la mort cardiaque subite. But = identifier déterminant pouvant expliquer la cause du décès (taux détection de 13%) et identifier membre de la famille à risque

Answer 9

Généralités -désordre génétique du métabolisme des lipides associé à élévation des concentrations plasmatique du LDL-Cholestérol -niveau élevé LDL-C entraîne développement prématuré maladie cardiovasculaires athérosclérotiques (MCVAS) --apparaît tôt dans la vie si patient non-traités -si HF demeure non-traité: risque développer MCVAS est de --50% chez homme avant 50 ans --30% chez femme avant 60 ans Prévalence: HF hétérozygote 1/250 vs HF homozygote 1/16000 à 1/300000, Effet fondateur 1/81 à 1/270 Canadiens français Semi-dominant (gravité change selon le variant pour chaque individu) Présentation clinique: élévation niveau LDL-C circulant (indiv non-traités) -HF hétérozygote : LDL-C: 5-13 mmol/L -HF homozygote: LDL-C: > 13 mmol/L -Xanthome tendineux, Xant. jointure main, Xanthélasmas, Arcs cornéens Bases moléculaires: dans tous les cas = augm. LDL-C dans circulation l’une n’est pas nécessairement plus “dangereuse” qu’une autre -LDLR (85-90%) -ApoB (5-10%) -PCSK9 (< 5%) -LDLRAP1 (rare) Implications clinique de la génétique: -Dx précoce essentiel (traitement hypocholestérolémiant prévention) et dépistage membre de la famille au premier degré -pronostic patient traité: hétéroz = vie normale, homoz = MCVAS repoussée dans le temps par aphérèse plasmatique -connaissance génétique = contribution majeure (dév. traitement) --statine qui cible synthèse de novo du cholestérol --anticorps monoclonaux contre PCSK9

Answer 10

Généralités -maladie neuromusculaire caractérisée par atrophie et faiblesse musculaires progressives dues à dégénérescence progressive des muscles squelettiques, lisses et cardiaques -défaut protéine dystrophine (protéine musculaire exprimée principalement dans muscles squelettiques, lisses et cardiaques et certaines neurones) Récessif liée à l’X (Prévalence: 1 naissance (sexe masculin) sur 3500) Présentation clinique: -Naissance à 2 ans: --garçons relativement normaux --Niveau plasmatique de CK élevés (10-100 fois la normale) -3-5 ans: --faiblesse musculaire, chutes fréquentes (enfant maladroit) --pseudohypertrophie des mollets --Signe de Gowers (façon de se lever = caractéristique) -Vers l’âge de 12 ans: --Garçons se déplacent en chaise roulante --légère déficience intellectuelle --complications cardiaques et pulmonaires Bases moléculaires: 3 catégories de variants dans DMD (plus long gène, bcp variants) 1) larges délétions dans le gène DMD (65%) 2) larges duplications (10%) 3) Petites insertions/délétions ou SNPs (25%) Implications clinique du Dx moléculaire: -Dx en cherchant larges délétions et duplication -dépistage familiale = indication 1ère du Dx -études morphologiques et immunohistochimie permettent Dx mais invasifs

Answer 11

-prédiction du risque de développer une maladie à partir de génotypage de milliers/millions variants dans l’ADN -maladie coronarienne, fibrillation auriculaire, cancer du sein, diabète de type 2, maladies inflammatoires chroniques de l’intestin -calcul de score de risque qui s’en vient à court terme.

Answer 12

-requête d’analyse -formulaire consentement pour un test génétique (unique province à venir) -conservation des enregistrements -banquage des échantillons (sang total vs ADN purifié) -système informatique de laboratoire spécialisé en génétique aide bcp (tracking des échantillons entre autres)

Answer 13

Système fermé: conception empêche contact avec produits réactions intermédiaire ou finaux (automatisé en système fermé-cassette). -circuit unidirectionnel non-nécessaire -ex: IDnow pour Covid Système ouvert: implique au moins 1 étape d’amplification des acides nucléiques, comporte 3 ou 4 zone permettant la séparation des activités et éviter la contamination de l’échantillon -circuit unidirectionnel essentiel

Answer 14

Généralement en 3 zones (1 vers 3 sans retour arrière possible): -Zone 1, propre (entreposage et préparation réactifs et préparation MasterMix) Pression positive pousse l’air à l’extérieur -Zone 2, salle (préparer les spécimens et isolation des acides nucléiqes) Pression négative pour ne rien pousser à l’extérieur de la pièce -Zone 3, très salle (zone d’amplification et détection) Pression négative pour éviter contamination avec amplicon à l’extérieur

Answer 15

-centri brièvement les tubes avant ouverture -ouverture et fermeture minutieuse des tubes -embouts pipette avec filtre -refermer chaque échantillon avant d’en ouvrir un autre (rémanence) -Aliquoter réactifs (éviter rémanence) -port des gants -respect flux directionnel -préparation et distribution du MM avant ajout ADNg -Ergonomie!

Answer 16

1) sélection de l’approche (seq. génome/exome/profil de gène) 2) validation (guide de l’INESSS pour validation en Bio Mol) 3) qualité: matériel référence (important pour validation et CQi/CQe) -ADNg extrait sang total = stable mais pas assez grand qté pour long terme -ADNs Corriel (ADNg provenant de lignées cellulaires, facilement téléchargeable base données publiques 3) Contrôle de la qualité -CQi: positif (faible qté ADN pour éviter rémanence) et négatif (tout sauf ADNg), effectué à chaque essai, idéalement ch étape a son CQi -CQe: programmes offerts (CAP, ECMN, GenQA) --se comparer avec les pairs --sur une base périodique doivent être traités comme --échantillons patients