Tutorium 6 Flashcards
Welche DNA-Replikationsmodelle gibt es ?
Konservativ
->die ursprümgliche Helix bleibt erhalten, zwei vollkommen neu synthetisierte Stränge werden zu einer zweiten Helix verbunden
Semikonservativ
- > jedes neue DNA-Molekül besteht aus einem Strang der ursprünglichen Helix und einem neu synthetisierten Strang
- -> erwies sich als richtig
Dispersiv
->die beiden parentalen Stränge werden komplett aufgeteilt und in Einzelstücke mit neu synthetisierten Stücken zu zwei neuen Doppelhelices zusammengefügt
Experimenteller Nachweis zur DNA-Replikation
Prokaryoten
- > Meselson und Stahl
- > Versuche mit schwerem und leichten Stickstoff
- > Versuch: Medium mit schweren Stickstoff; schwerer Stickstoff zeigt sich in DNA nach 1.Generation je weiter generativ desto mehr schwerer Stickstoff
Eukaryoten
- > Taylor, Woods und Hughes
- > Versuche mit Wasserstoffisotopen in Thymin
Wo beginnt die DNA-Replikation
Origin of Replication
In wie viele Richtungen wird die DNA repliziert
Bidirektional: Ausbildung von zwei Replikationsgabeln
Wie viele Ursprungspunkte der Replikation gibt es in Bakterien/Eukaryoten
Bakterien: 1
Eukaryoten: viele
DNA-Polymerase
DNA-Polymerase katalysiert die DNA Synthese
Sie benötigen: DNA-Matrizen (template) dNTPs Primer Mg2+-Ionen
Wie verläuft die Elongation von DNA
Elongation in 5’-3’ Richtung
->Nucleotide werden am 3’-Ende angebracht
Polymerase I, II, III
DNA-Polymerase I, II, III könne die DNA elongieren, die Elongation aber nicht einleiten
->Alle drei können Fehlpaarungen während der Replikation erkennen und ausbessern –>Proofreading
(aufgrund der 3’-5’-Exonukleaseaktivität)
Nur Polymerase I kann Primer ausschneiden und Lücken auffüllen
6 Probleme bei der DNA-Replikation
- Entwindung der Helix
- Reduzierung der dadurch entstandenen Spannungen (coiling)
- Primer-Synthese
- Diskontinuierliche Synthese des 2. Strangs
- Entfernung von RNA-Primern, Verbindungen der aufgefüllten Lücken mit dem DNA-Strang
- Fehlerkorrektur
wie wird die DNA entwunden
DnaA
->(Protein) bindet an den Replikationsursorung und führt die ersten Schritt des DNA-Aufwindens druch
DnaB
->werden rekrutiert, vom DnaC
DnaC
->Protein angetrieben Helikasen nutzen Energie (ATP-Hydrolyse), um die WBB zu brechen
Welches Enzym führt zur Entspannung der DNA
DNA-Gyrase (eine DNA-Topisomerase)
Primer
- Polymerase III benötugt ein freies 3’OH-Ende
- Primase synthetisiert kurze RNA Primer
- Polymerase I ersetzt RNA-Primer durch DNA
Diskontinuierliche Synthese
- Bildung von Okazaki-Fragmenten am diskontinuierlichen Strang
- DNA-Polymerase I ersetzt RNA-Primer durch DNA
- DNA-Ligasen verbinden sie einzelnen Fragmente
Proofreading
druch 3’-5 Exonucleaseaktivität der DNA-Polymerase
Kurzfassung Replikation
- DNA polymerase III
- single.stranded binding proteins
- DNA gyrase
- DNA helicase
- RNA primers
Wie unterscheidet sich die eukaryotische zur prokaryotischen Replikation
Eukaryoten
- > lineare Chromosomen
- > Proteine, die mit der DNA Komplexe bilden
Daher:
- mehrere Replikationsurprünge
- zeitliche Steuerung der Replikation notwendig
eukaryotische DNA Polymerasen
Alpha
->4 Untereinheiten
-> keine 3’-5’-Exonuklease
Funktion: RNA/DNA-Primer, Initiierung der DNA-Synthese
Delta
->4 Untereinheiten
->mit 3’-5’-Exonuklease
Funktion: Synthese des Folgestrangs, DNA-Reperatur, Korrekturlesen
Epsilon
->4 Untereinheiten
->mit 3’-5’-Exonuklease
Funktion: Synthese des Leitstranges, Korrekturlesen
Gamma
->2 Untereinheiten
->mit 3’-5’-Exonuklease
Funktion: DNA-Replikation und Reparatur in den Mitochondrien
Telomerase
Ribonukleoprotein = Protein + RNA
Telomerase synthetisiert die sich wiederholenden Sequenzen der Telomere
RNA dient als Matritze für die DNA-Synthese
->Reverse Transkription
Schritte der Rekombination von DNA
Bestandteile der genetischen Rekombination
- Nicking (Einzelstrangbruch druch Endonuklease
- Entfernung eines Stranges und Paarung mit komplementären Strang
- Ligierung
- Wanderung des Stranges (branch migration)
- Separation der Duplex, sodass die charakteristische Holliday-Struktur entstehen
Wodurch können Mutationen herbeigeführt werden
- Radioaktive Strahlung
- UV-Licht
- Natürliche und synthetische Chemikalien
- -> Mutagene
Luria-Delbrück-Fluktuattionsteste
Ziel des Tests:
Untersuchung der Resistenzbildung von Bakterien gegenüber Bakteriophagen
zwei mögliche Ergebnisse
A- Wenn die Mutation durch die Phagen iduziert wird, tritt in jeder Kuktur eine ähnliche Anzahl an ressistenten Bakterien auf
B-Wenn Mutationen spontan und damit unabhängig von dem Anwesen der Phagen geschehen ist starke Fluktuation zu erwarten
Experiment zeigt Typ B
Formen von Punktmutationen (Basenaustausch)
Missens Mutation
->anderer Triplet-Code codiert für andere AS
Nonsense Mutation
->anderer Triplet-Code codiert für Stop-Codon
Silent Mutation
->anderer Triplet-Code codiert für die selbe AS
Transitionen
Pyrimidin durch Pyrimidin
Purin druch Purin
Transversionen
Pryrimidine durch Purine ersetzt oder andersherum
Leserasterverschiebung/
Rastermutation
durch Insertion/Deletion von Basen verschiebt sich das Leseraster
konditionale Mutationen
Expression der Mutation hängt von z.B. Umweltfaktoren ab
Bsp. Temperatursensitive Mutation
->temperaturabhängige Fellfarbe im Himalaya Kaninchen
Ursachen für Proofreading
-Fehler beim Proofreading
- Tautomerie-Umwandlung
- > führt zu permanenten Mutationen und das Basen nicht mit ihren üblichen Basen paaren
- Depurinierung/Depyrimidierung
- > Verlust einer Stickstoffhaltigen Base
- Replication Slippage
- Desaminierung (C->U)
- Oxidative Schäden
- Transposons
- > mobile DNA-Elemente, die ihre Position innerhalb eines Genoms ändern können
- > Integration von Transposons kann zur Mutation führen
künstliche Mutationen
Toxine/Chemikalien
- Basenanaloga
- Alkylierende Agentien
- Interkalierende Agentien
- Addukt formierende Agentien
Strahlung
- Röntgenstrahlung
- UV-Strahlung
- > Dimerisierung zweier identischer Pyrimidinbasen
ß-Thalassemie
kann durch viele verschiedene Mutationen hervorgerufen werden
- > automal rezessiv
- > Blutkrankheit gekennzeichnet durch eine reduktion oder Abwesenheit von Hämoglobin
250 Mutationen im ß-Globin-Gen
schwere bis leichte Symtome: Schwäche, verzögerte Entwicklung, Gelbsucht, vergrößerte Organe
Chorea Huntington
mutierte gene enthalten Trinucleotid wiederholende Sequenzen
normal 30 repeats
Krank 200 repeats
->Erhöhte Wahrscheinlichkeit für Polymerase slippage
Fehlerrate DNA Polymerasen
10v5-10v7 Basen
normaterweise: Proffreading
Falls Proffreading nicht erfolgt: Mismatch repair
Mismatch repair E.coli
- Mut L und Mut H versammeln sich mit Mut S an der Seite der Mismatch-Stelle der neu synthetisierten DNA
- Mut H ist aktiviert und schneidet an dem neu synthetisierten Strang
- Die DNA mit dem Mismatch wird abgebaut von einer Endonuklease
- Die so entstandene entnommene Stelle wird aufgefüllt durch resynthese wodurch der Mismatch korrigiert wird
Postreplikation
- > findet stratt, wenn die beschädigt DNA nicht fertig repliziert wurde
- > Durch Rekombinationsprozesse wird die vollständige, richtige, komplementäre Sequenz des Parentalstrangs rekrutiert und die Lücke gegenüber des Fehlers eingefügt
Die neu entstandene Lücke wird durch DNA-Polymerase und DNA-Ligase gefüllt
Photoreaktivierung
Photoreaktivierungsenzym (PRE)
- > Photolyase
- > bricht Bindungen zwischen zwei dimerisierten Pyrimidinen
- > dazu muss ein Enzym ein Photon absorbieren
kommt nicht bei Menschen vor
BER
Base Exicsion Repair
->korrigeiert falsch eingefügte Basen in der DNA
=nur Base wird geändert
NER
Nucleotid Excision Repair
->korrigert größere Läsionen in der DNA, die den Zusammenhalt der Doppelhelix stören
DSB repair
Doppelstrangbruchreperatur
verbindet zwei gebrochene DNA Stränge
Homologus recombination repair
->während später S oder früher G2 Phase
Nonhomologous end joining
->aktiviert während G1-Phase
Ames Test
Ziel: Detektion mutagener Substanzen
- Mutationsrate auxotropher Bakterien auf Minimalmedium wird beobachtet
- Vermehrte Bildung von Kolonien ist Indikator für Mutagenität (weil ohne Mutation nicht lebensfähig)
- Leberenzyme von Ratten simulieren Stoffwechselprozesse
Genetic screens
Forward Genetics
Mutagenesis ->Phenotyp -> Gen
–>Aufklärung von Genen die zu einem (Mutanten-)Phänotypen führen
Reverse Genetics
Gen->Mutagenesis -> Phenotyp
–>Untersuchung der Funktion einzelner Gene
Chemical Genetics
Chemical -> Phenotyp -> Gen
–>Untersuchung der Auswirkung von Chemikalien auf Zelle zur Identifikation beteiligter Proteine/Enzyme
Transposons allgemein
Transponierbare DNA-Elemente haben keine definierten Platz im Gen und können ihre Position durch Transposition wechsel
- > sind in genomen aller Organismen vorhanden
- > machen einen großen Anteil in eukaryotischen Genomen aus
TE in Mais
Zwei Mutationen Dissociation (Ds) und Activator (Ac) sind transponible Elemente in Mais
->Das Versetzten von Ds-Gene hängt von der Transposonaktovität der Ac-Gene ab
- > Ds springt ins W gene und inaktiviert es somit
- > kann auch wieder rausspringen
Aubau TE
->wird flankiert von Terminal Inversiv Repetetiv Sequences (IRs oder TIRs)
- > TE codiert das Enzym Transposase
- bindet an TIR
- schneidet an den Endern der TIRs
zum einfügen
->schneidet versetzt und füllt auf
TE- Strukturelle Unterschiede
Insertionselemente
- häufig nur 1-2 kb
- codieren nur Transposase-Gene
Transposons
- etwa 5-20 kb
- codieren neben Transposase Gene weitere Gene
a)zusammengesetzte Transposons/
composite Transposons
b)einfache transpososn
simple Transposons
Transpositionsmechanismen
1.Cut-and-paste
TE wird beim Donor ausgeschnitten und komplett an der Zielregion eingesetzt
2.Copy-and -paste
TE wird kopiert während der Transposition
Biologische Funktion von TEs
Inaktivierung von Genen: Insertion unterbricht Gene
->Mutation
Aktivierung von Genen: Promotot-out Aktivität
- > Transposons besitzten outside-reading promotors (pvout)
- > können Genexpressionen modulieren
Bereich homologer Rekombination
