Transformation d'une souche de S. cerevisiae avec de l'ADN exogène

Question 1

Pourquoi la transformation est une étape critique de ce projet ?

Answer 1

Car la probabilité d’obtenir des cellules (clones) qui portent un gène muté, impliqué dans le métabolisme cibés, est faible.

Question 2

Quels sont les facteurs qui permettent d’augmenter la probabilité d’une transformation réussie?

Answer 2

• la qualité de la préparation des cellules compétentes, de l’ADN à introduire dans ces cellules et des solutions est tout autant importante que la qualité des manipulations pour la procédure même de la transformation.

Question 3

Quels sont les 3 grandes étapes de la transformation ?

Answer 3

1) préparation de l’ADN transformant à partir d’une banque génomique
2) préparation des cellules compétentes
3) La transformation

Question 4

Sous quel format doit se trouver l’ADN transformant pour transformer une levure?

Answer 4

sous forme d’ADN linéarisé pour favoriser la recombinaison homologue requise pour effectuer la mutagenèse.

Alors le plasmide doit-être linéarisé à l’aide d’une enzyme de restriction

Question 5

Quels caractéristiques doit posséder l’enzyme de restriction pour cette expérience ?

Answer 5

• Fréquence de coupe relativement basse = enzymes qui reconnaissent des séquences de 6 paires de base et plus.
• Elle ne doit pas couper à l’intérieur du gène d’intéret
• Riche en % GC puisque celui du génome de la levure est de 38% GC

Question 6

Quel est le but de la préparation de l’ADN transformant à partir d’une banque génomique ?

Answer 6

Linéariser les vecteurs de la banque génomique S. cerevisiae mutagénisés (contenant le minitransposon mTn3-LacZ/LEU2 d’origine bactérienne) en les digérant avec l’enzyme de restriction NotI, afin de favoriser la recombinaison homologue requise pour effectuer la mutagénèse.

(Oui oui c’est copier coller du cahier de lab XD)

Question 7

Suite à l’incubation de 2 heures à 37 °C de la préparation, pourquoi il faut la faire incuber 30 minutes à 65 °C ?

Answer 7

Cette étape permet d’inactiver l’enzyme afin de protéger l’ADN dans la préparation.

Question 8

Pourquoi l’enzyme de restriction NotI à été choisi pour cette expérience ?

Answer 8

· Parce que Notl est peu enclin à couper dans les fragments d’ADN génomique de la levure contenant le mini transposon mTn3-lacZ/LEU2.

· NotI a une faible probabilité de couper à l’intérieur de l’insert (faible fréquence de coupe, car reconnait une séquence de 8 paires de bases GC^GGCCGC, en plus d’un fort % en GC).

· Le site de restriction est double dans la séquence du vecteur pHSS6-SaII et de chaque coté de l’insert.

· Cette enzyme de restriction est suffisamment éloigné du gène de résistance à la Kanamycine .

Question 9

Quels sont les résultats attendus sur le gel d’agarose 0,8% suite à la digestion enzymatique ?

Answer 9

• L’échantillon non-digéré devrait avoir une bande entre 10,8 et 12,4 kb.
• L’échantillon digéré devrait avoir 2 bandes, une correspondant au vecteur d’environ 2,3 kb, et l’autre correspondant à l’insert d’environ 8,5 à 10,1 kb.

Question 10

Qu’est-ce qu’un cellule dites “compétente” ?

Answer 10

c’est un cellule apte à recevoir de l’ADN exogène.

Question 11

Que dois contenir le microtube pour la digestion enzymatique?

Answer 11

• Le tampon NEB selon l’enzyme choisi
• l’ADN à concentration finale de 2,5 ug
• l’enzyme de restriction
• de l’eau stérile pour un volume finale de 10 uL

Question 12

Quel est le traitement qui permet de rendre compétente les cellule de S. cerevisae ?

Answer 12

-Traitement avec des sels de lithium principalement l’acétate de lithium (LiAc)

Question 13

Pourquoi les cellules compétentes doivent être utiliser immédiatement ?

Answer 13

Car la compétente des cellules diminue rapidement après leur préparation. Elle peuvent être utiliser dans les 2 à 3 jours suivant mais l’efficacité de la transformation sera plus faible.

Question 14

Pourquoi il est important d’appliquer les techniques d’asepsie pour toutes les manipulations avec les levures?

Answer 14

• Car on utilise des milieux riches et sans antibiotique, qui sont favorables au développement de contaminants.
• Si de nbx contaminants sont observables suite à la transformation, ils sont probablement issus de la préparation des cellules compétentes.

Question 15

Quel est la source la plus fréquente de contamination des cellules compétentes?

Answer 15

L’utilisation des micropipettes par contamination du piston de la micropipette par l’aérosol généré lors de pipettage rapide.

Question 16

Pourquoi faut-il incuber de 4 à 8 heures un erlenmeyer avec du milieu YEP/glucose inoculé à 30°C avec agitation forte ?

Answer 16

Il est important d’obtenir une densité optique à 600 nm de 1,0 à 1,2, car cela correspond approximativement à une densité cellulaire de 2x10^7 cellule/mL. Il est important d’obtenir une biomasse totale élevé et en croissance exponentielle pour la préparation de la compétence cellulaire.

Question 17

Quel densité cellulaire est attendu à la fin de la préparation des cellules compétente ?

Answer 17

Les cellules suspendues dans un volume finale de 500 µL de TE/LiAc 1x devrait correspondre approximativement à 2x10^9 cellules/mL.

Question 18

Pourquoi est-il important d’obtenir un grand nombre de colonies suite à la transformation ?

Answer 18

Car le nombre de mutants incapables d’utiliser le glycérol représente un très faible pourcentage de l’ensemble des mutants générés. Alors 2 transformations en parallèle sont effectuer.

Question 19

Pourquoi la transformation est effectuer (cellules compétentes + ADN transformé) en présence d’ADN de sperme de saumon, d’acétate de lithium (LiAc) et de polyéthylène glycol (PEG) ?

Answer 19

Car la présence de LiAc perméabilise (fragilise) les membranes.

Le PEG facilite l’adsorption de l’ADN à la cellule et augmente également la perméabilité membranaire.

L’ADN de sperme de saumon augmente l’efficacité de la transformation.

Question 20

Que contient les microtubes pour la transformation ?

Answer 20

• 10 µL d’ADN transformant linéarisé (250 ng)
• 5 µL d’ADN de sperme de saumon dénaturé à 95°C et fragmenté.
• 50 µL de cellules compétentes.
• 330 µL d’une solution de PEG/TE/LiAc

Question 21

Un témoin sans ADN est essentiel pour cette méthode, à quoi sert-il ?

Answer 21

Il n’y a pas de biosynthèse de leucine chez Saccharomyces cerevisiae MVY800. Ainsi, seules les cellules qui ont acquis la capacité de synthétiser la leucine via le mTn3 peuvent croître sur le milieu SC-Leu/glucose (ce milieu est exempt de leucine).

Donc, le témoin sans ADN permet de s’assurer qu’il n’y a pas de contamination, car rien ne devrait croître puisque les cellules sans ADN ne possède pas le mTn3 et ne peuvent donc pas synthétiser la leucine.

Question 22

Quels sont les événements génétiques qui surviennent au cours de cette expérience ?

Answer 22

Au cours de la transformation avec l’ADN de la banque génomique, le fragment d’ADN (portant le mini transposon Tn3) à été intégré dans le chromosome de Saccharomyces cerevisiae par recombinaison homologue. Ainsi, la recombinaison homologue a permis de remplacer un gène sauvage par le gène muté correspondant.

Question 23

Quel est le but de l’expérience de transformation ?

Answer 23

Obtenir des mutants incapable d’utiliser le glycérol par recombinaison homologue des fragments d’ADNg de la banque génomique mutée préalablement digérés du vecteur pHSS6- SaII (contenant l’ADNg de S. cerevisiae et le minitransposon mtn3-lacZ/LEU2) dans des cellules Saccaromyces cerevisiae MVY800 compétentes.

Question 24

Pourquoi l’incubation en position inversé à 30 °C, dans un sac de plastique entrouvert est recommandé?

Answer 24

• La position inversé empêche la contamination par l’humidité accumulé dans le couvercle de la gélose en boite de pétri
• 30°C est la température optimal de croissance de S. cerevisae
• Le sac de plastique permet de prévenir l’assèchement des géloses

Question 25

Que devrions-nous obtenir après 48 hrs d’incubation?

Answer 25

• des colonies comprise entre 2 et 3 mm

- une bonne transformation devrait produire entre 1000 et 4000 clones, pour les volumes étalés.

Question 26

Sur quel milieu est étalé les cellules transformées?

Answer 26

• Sur des milieux SC-Leu/glucose. Des milieux sans leucine avec du glucose comme source de carbone

Question 27

Pourquoi le taux de transformation doit être exprimé par quantité d’ADN ( /ng ou / ug d’ADN) et en % de cellule transformée p/r à la quantité initiale des cellules utilisées dans la transformation?

Answer 27

Car le taux de transformation varie selon la quantité d’ADN transformant ainsi que la quantité des cellules compétentes.

Cette mesure donne une idée de l’éfficacité de la méthode mais, il ne faut pas oublier qu’elle est également biaisée par la méthode de sélection utilisée,